Estudio estructural y funcional de proteínas formadoras de poros de venenos

• Autores: Esperanza Rivera de Torre
• Directores de la Tesis: Jose Gregorio Gavilanes Franco (dir. tes.), Álvaro Martínez del Pozo (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2020
• Idioma: español
• Títulos paralelos:
  • Structural and functional characterization of venom pore-forming proteins
• Tribunal Calificador de la Tesis: Julián Gómez Gutiérrez (presid.), Lucía García Ortega (secret.), Elias Herrero Galan (voc.), Thomas Nyholm (voc.), Maria Ikonomopoulou (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad Complutense de Madrid
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Proteínas
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
• Resumen

  • Las proteínas formadoras de poros (PFPs) constituyen una familia de toxinas capaces de matar células por choque osmótico, al formar poros en sus membranas. Las actinoporinas son PFPs producidas por anémonas marinas como parte de su veneno. Son pequeñas y suelen tener un punto isoeléctrico básico. Aparecen como familias multigénicas, con distinta toxicidad, pero con una estructura común, caracterizada por un sándwich B flanqueado por dos hélices. Se unen a la esfingomielina de las membranas, extienden su segmento helicoidal N-terminal, oligomerizan y forman un poro selectivo de cationes, insertando dichas hélices a través de su núcleo hidrófobo. Constituyen un modelo óptimo para estudiar la transición de una proteína soluble en agua a un estado integrado en membrana.

    Stichodactyla helianthus produce dos actinoporinas: las sticholisinas I y II (StnI y StnII), que son prácticamente idénticas, pero muestran una actividad diferente, siendo StnII mucho más hemolítica cuando se ensayan frente a eritrocitos ovinos. El estudio de las diferencias de sus secuencias N-terminales reveló la presencia de un puente salino clave en la funcionalidad de estas dos proteínas. Un puente salino que resalta cómo este tipo de interacción puede ser clave en el mantenimiento de la funcionalidad de ciertas proteínas.

    Usando mezclas de StnI y StnII y ensayos de entrecruzamiento, de hemólisis, de pérdida de impermeabilidad de vesículas lipídicas y de calorimetría, se demostró que ambas proteínas pueden actuar de forma sinérgica y ensamblarse en heteroporos funcionalmente activos. Esta sinergia representa un nuevo aspecto de la regulación de la actividad del veneno, aumentando su versatilidad tanto en respuestas de defensa como de ataque El transcriptoma de S. helianthus fue ensamblado de novo usando el método de secuenciación de RNA de Illumina. Gracias a este análisis transcriptómico se descubrió una nueva isoforma de actinoporina, denominada StnIII, que fue clonada y producida en E. coli. Su caracterización estructural mostró que conserva el plegamiento arquetípico de las actinoporinas y es funcionalmente activa, además de mostrar sinergia con StnII. Estos resultados refuerzan la complejidad de la red de relaciones establecida entre las actinoporinas, aumentando la importancia de su descubrimiento.

    La araña viuda negra (Latrodectus spp.) produce latrotoxinas (LTXs), que son proteínas enormes, con punto isoeléctrico ácido, que también forman poros. En este caso, en las presinapsis neuronales, provocando una liberación masiva de neurotransmisores. Se clasifican según la especificidad de su presa. Las latroinsectotoxinas (LITs), afectan específicamente a insectos y son interesantes por sus potencial aplicación como bioinsecticidas. Estas proteínas se ensamblan el conocido como complejo macromolecular latrotoxina, cuyos detalles estructurales y funcionales apenas se conocen, y en el que aparecen asociadas a unos péptidos pequeños, también ácidos, llamados latrodectinas.

    Las dos latrodectinas más abundantes del veneno de L. hesperus (LtdI y II), fueron clonadas, producidas en Pichia pastoris y purificadas a homogeneidad. Son péptidos ricos en estructura helicoidal, altamente termoestables y con sus 6 Cys formando enlaces disulfuro, como se confirmó por dicroísmo circular y espectrometría de masas. Los datos preliminares de RMN usando LtdII etiquetada con 13C-15N permitieron identificar dos regiones helicoidales. LtdII no mostró actividades insecticidas o antimicóticas.

    Delta-LIT de L. hesperus también fue clonada, producida en P. pastoris y purificada a homogeneidad. Su caracterización espectroscópica, sin embargo, fue compatible con un polipéptido no estructurado. Es necesario por tanto optimizar los protocolos utilizados.

    Una vez purificadas y bien caracterizadas, el estudio combinado de Ltds y delta-LIT permitirá dilucidar el mecanismo de actuación del complejo macromolecular latrotoxina, facilitando su posible aplicación como bioinsecticida.