Resumen de Nuevas aproximaciones de vigilancia de transmisión de Mycobacterium tuberculosis en entornos comunitarios complejos y de otros patógenos relevantes en el entorno nosocomial
- español
La aplicación de estrategias de caracterización molecular ha transformado el modo en el que abordamos el conocimiento de las dinámicas de transmisión de microorganismos patógenos. La reciente introducción del análisis genómico ha supuesto una segunda revolución en la capacidad de discriminación entre cepas y en la precisión en la que podemos abordar los estudios epidemiológicos. Sin embargo, son necesarios nuevos esfuerzos para definir el modo más adecuado de integrar las aproximaciones moleculares y genómicas y adaptarlas a diferentes retos epidemiológicos y entornos de análisis.
Con este fin, en esta tesis se han definido dos bloques de trabajo, atendiendo a infecciones i) de carácter comunitario, seleccionando a Mycobacterium tuberculosis como patógeno representativo y de alta relevancia global y ii) de naturaleza nosocomial, enfocándonos en Mycobacterium chimaera, como microorganismo responsable del problema emergente derivado de la exposición a dispositivos sanitarios contaminados, y en Pseudomonas aeruginosa MDR, microorganismo de gran relevancia en brotes que implican transmisión personapersona.
Cualquier intento de optimizar los sistemas de vigilancia de la transmisión de la tuberculosis (TB) deben enfrentar el nuevo escenario global de la enfermedad, como resultado de los movimientos migratorios internacionales. Siguiendo esta premisa, abordamos la caracterización de la transmisión de TB de alto riesgo, TBmultirresistente, en uno de estos ejes migratorios, el que incluye Latinoamérica y Europa. Nuestra investigación comenzó caracterizando mediante MIRU-VNTR una muestra de cepas MDR circulantes en Lima, Perú, que reveló una elevada tasa de transmisión reciente en esa población. La comparación de esos genotipos con los identificados en cepas circulantes en población migrante de Perú en Europa identificó cepas coincidentes en Italia y España. El análisis genómico determinó con precisión la existencia de dos eventos de exportación intercontinental de TB-MDR desde Perú a Europa, que implicaban a dos variantes de cepas circulantes en Lima, y que una de ellas había sido responsable de una transmisión activa posterior en Florencia.
El estudio integrado entre Perú y Europa reveló la necesidad de contar con datos genotípicos de las cepas circulantes de MTB que permitieran abordar estudios transnacionales similares en otros entornos. Lamentablemente, son numerosos los países de origen de migrantes que carecen de sistemas de epidemiología molecular sistemática. De esta necesidad, y tratando de compensar la brecha de conocimiento existente entre los países de origen y destino de migración desarrollamos una estrategia alternativa basada en i) genotipado sistemático por MIRU-VNTR de una muestra de la población a analizar para identificar las cepas más prevalentes, ii) caracterización por secuenciación de genoma completo (WGS) de los clusters prevalentes para identificar SNPs marcadores de cepa y iii) desarrollo de PCRs específicas dirigidas a esas cepas, que optimizaran y simplificaran su vigilancia prospectiva a bajo coste.
La estrategia se pilotó en Panamá. El genotipado por MIRU-VNTR de una colección de cepas en dos provincias de Panamá (Panamá y Colón) reveló una alta proporción (50%) de aislados de MTB agrupados en cluster, con una distribución asimétrica de algunas cepas, predominantes, bien en Colón, bien en Panamá. El análisis por WGS de parte de estos clusters permitió evidenciar que únicamente uno de ellos correspondía a eventos de transmisión reciente, con aislados mostrando baja diversidad entre ellos, mientras que el resto correspondían a cepas prevalentes. El diseño de una serie de PCRs especificas permitió asegurar la vigilancia prospectiva in situ de estas cepas, responsables de un tercio del total de casos de TB de las poblaciones estudiadas.
Una de las cepas prevalentes en Colón correspondió al linaje Beijing. Debido a que este linaje se ha asociado a una elevada virulencia y transmisión, se realizó una actualización rápida de su presencia en Colón, apoyados en una PCR específica, lo que reveló que es responsable del 57% de los casos incidentes. El estudio integrado de los datos de WGS de todos los aislados identificados, junto con los disponibles en bases de datos globales, permitió determinar que pertenece a un sublinaje Beijing moderno, la rama asiática africana 3 (Bmyc13, L2.2.5), y que su posible entrada a Panamá pudo ocurrir desde Vietnam, como indican los aislados más próximos filogenéticamente. El estudio de la diversidad acumulada por los representantes de esta cepa en Panamá permitió inferir que el período más probable para su entrada en el país fue entre los años 2000 y 2012.
Dada la rentabilidad en el estudio de la transmisión de TB de la aplicación de nuestra estrategia combinada de genotipado dirigido, WGS y desarrollo de PCRs específicas de cepas, era oportuno evaluar su transferibilidad al segundo área de interés de esta tesis, las infecciones nosocomiales. Para ello, replicamos el esquema de trabajo desarrollado para TB en la caracterización de un brote por P. aeruginosa XDR, que implicaba a 14 pacientes, que se estaba abordando con genotipado convencional (electroforesis de campos pulsados). El análisis por WGS y la consiguiente PCR específica de cepa dirigida a SNPs marcadores identificados en el estudio genómico, permitió descartar casos no relacionados, e identificar casos nuevos que no habían sido sospechados. Además, definió la existencia de brotes solapantes de menor dimensión, permitió determinar el verdadero caso índice, y finalmente, alertar de que el brote se mantenía aún activo en el momento del análisis.
Por último, dentro de nuestro interés de optimizar la vigilancia de transmisión nosocomial, y tras habernos enfocado en la modalidad de transmisión personapersona, era oportuno atender a eventos que implicaban exposición a dispositivos sanitarios contaminados. La reciente alarma global derivada de la exposición de pacientes sometidos a cirugía cardíaca a dispositivos “Heater-cooler” (HCU) contaminados con Mycobacterium chimaera justificó nuestra atención sobre este segundo evento como modelo de estudio. Como respuesta, evaluamos la utilidad de aplicar una PCR en tiempo real para la identificación de M. chimaera, basada en el análisis genómico de sus secuencias específicas, con el fin de dar una doble respuesta para: i) optimizar la vigilancia ambiental prospectiva, directamente sobre las muestras de agua de los dispositivos HCU e ii) identificar retrospectivamente casos infectados por este microorganismo que hubieran pasado desapercibidos. La estrategia mostró su utilidad para la identificación precoz de dispositivos HCU contaminados, permitiendo su monitorización y desveló la infección por M. chimaera en un paciente que había sido sometido a cirugía cardíaca en una institución diferente a la nuestra. El estudio por WGS del aislado del paciente y de los obtenidos de los dispositivos contaminados, permitió demostrar la participación de la cepa responsable del brote global.
- English
The application of molecular strategies has transformed the way in which we approach the analysis of pathogenic microorganisms transmission dynamics. The recent introduction of genomic analysis has caused a second revolution in the ability to discriminate between strains and in the precision in which we can approach epidemiological studies. However, further efforts are needed to define the most suitable way to integrate molecular and genomic approaches and to adapt them to different epidemiological challenges and analytical settings.
With this aim, this thesis has been organized in two work packages, focusing on infections i) at the community setting, selecting Mycobacterium tuberculosis as a representative pathogen with a high global relevance, and ii) at the nosocomial context, selecting Mycobacterium chimaera, as a microorganism responsible for the emerging alarm derived from exposure to contaminated health-care devices, and MDR Pseudomonas aeruginosa, a relevant microorganism as responsible for outbreaks involving person-toperson transmission.
Any attempt to optimize tuberculosis (TB) transmission surveillance must face the new global scenario for this disease, as a result of international migratory movements. Following this premise, we approach the characterization of high-risk TB, multidrug-resistant TB, transmission in one of these migratory axes, the one involving Latin America and Europe. We started characterizing by means of MIRU-VNTR a sample of MDR circulating strains in Lima, Peru, which revealed a high rate of recent transmission in that population.
The comparison of those genotypes with those identified circulating among the Peruvian migrant population in Europe identified shared strains in Italy and Spain. Genomic analysis accurately determined the existence of two intercontinental exportation events of MDR-TB, from Peru to Europe, involving two variants of circulating strains in Lima, one of them being responsible for a subsequent active transmission in Florence.
The integrated study between Peru and Europe revealed the need for acquiring genotypic data from circulating MTB strains, which would allow to perform similar transnational studies in other settings. Unfortunately, there are many countries of origin of migrants that lack systematic molecular epidemiology programs. From this limitation, and trying to compensate the knowledge gap between the host countries and the countries of origin of migrants, we designed an alternative strategy based on i) systematic genotyping by MIRU-VNTR of a sample from the population to be analyzed, in order to identify the most prevalent strains, ii) characterization by whole genome sequencing (WGS) of the prevalent clusters to identify strain-marker SNPs and iii) tailoring specific PCRs targeting those strains, which will optimize and simplify their prospective low-cost surveillance.
A pilot study for this strategy was run in Panama. A collection of strains from two Panama provinces (Panama and Colon) was genotyped by MIRUVNTR, and revealed a high proportion (50%) of MTB clustered isolates, with an asymmetric distribution of some strains, predominant either in Colon or in Panama. The analysis by WGS of these clusters allowed us to determine that only one of them corresponded to recent transmission, with isolates showing low diversity among them, while the remaining corresponded to prevalent strains. The design of a set of specific PCRs made it possible to ensure prospective on-site surveillance of these strains, which were responsible for a third of all TB cases in the populations studied.
One of the prevalent strains in Colon corresponded to the Beijing lineage. Because this lineage has been associated with high virulence and transmission, a rapid update of its presence was carried out in Colon, supported by a specific PCR, revealing that it is responsible for 57% of all incident cases.
The integrated study of the WGS data from all the isolates, with those available in global databases, made it possible to determine that it belongs to a modern Beijing sublineage, the African Asian branch 3 (Bmyc13, L2.2.5), being Vietnam the most likely origin, as indicated by the phylogenetically closest isolates. The study of the diversity accumulated by this strain representatives in Panama allowed us to infer that 2000-2012 was the most likely period for its entrance to the country.
Given the cost-effectiveness shown by our combined strategy of directed genotyping, WGS and development of strain-specific PCRs, in the study of TB transmission, we pursued to evaluate its transference to the second area of interest of this thesis, nosocomial infections. With this aim, we replicated the work scheme developed for TB, now for the characterization of an XDR P. aeruginosa, involving 14 patients, which had been approaches only by conventional genotyping (pulsed field electrophoresis). The analysis by WGS and the consequent strain-specific PCR targeting strain-marker SNPs identified from the genomic analysis, allowed us to rule out unrelated cases and to identify another new cases that had not been suspected. In addition, it defined the existence of overlapping outbreaks of a smaller magnitude, identified the true index case, and finally, alerted that the outbreak was still active at the time of analysis.
Finally, due to our interest in optimizing nosocomial transmission surveillance, and after having focused on an example of person-person transmission, it was appropriate to focus on other events involving exposure to contaminated health-care devices. The recent global alarm caused by the exposure of patients undergoing cardiac surgery to “heater-cooler” (HCU) devices contaminated with Mycobacterium chimaera justified our attention on this second event as a study model. We evaluated the usefulness of applying a real-time PCR. based on the genomic identification of specific M. chimaera sequences, for the fast identification of this bacteria, in order to assure a double response to: i) optimize prospective environmental monitoring, analyzing directly water samples from the HCU devices and ii) retrospectively identify cases infected by this microorganism that would have gone unnoticed. The strategy showed its usefulness for the early identification of contaminated HCU devices, allowing their monitoring and revealed M. chimaera infection in a patient who had undergone cardiac surgery in an institution different from ours.
The WGS study of this patient isolate and of those obtained from the contaminated devices, allowed us to demonstrate the involvement of the strain responsible for the global outbreak.
