Función de rhoe in vivo: la ausencia de rhoe provoca alteraciones en el desarrollo del sistema nervioso
- Autores: Enric Mocholí
- Directores de la Tesis: Ignacio Pérez Roger (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad CEU - Cardenal Herrera ( España ) en 2010
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: María Isabel Fariñas Gómez (presid.), Judit Herrero Danés (secret.), Hugo Cabedo Marti (voc.), Mara Dierssen (voc.), Teresa Iglesias Vacas (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Las proteínas Rho son GTPasas monoméricas de pequeño tamaño homólogas a Ras. Forman una familia de 20 miembros, que se pueden clasificar por su secuencia y su función. Como los miembros de la familia Ras, las proteínas de la familia Rho contienen modificaciones lipídicas en su estructura que les permiten anclarse a la membrana celular y oscilar entre dos estados conformacionales: un estado activo, donde permanecen unidas a GTP, y otro inactivo, unidas a GDP. La unión a la molécula de GTP se produce a través de un factor intercambiador de nucleótidos de guanina específico de Rho (Rho-GEF), mientras que la hidrólisis de GTP es estimulada por una proteína activadora de GTPasa (Rho-GAP).
La activación de receptores de factores de crecimiento e integrinas promueve el cambio GDP/GTP en las proteínas Rho, lo que provoca un cambio conformacional activado y su interacción con múltiples efectores, modulando así su actividad y localización. Por ejemplo, muchos de los efectores de proteínas Rho son kinasas, capaces de controlar funciones celulares a través de la fosforilación de proteínas como la kinasa activadora de p21 (PAKs), capaz de unirse a Cdc42 y Rac1, o las kinasas ROCK (BhQ associated _goiled-coil-forming fs:inases), que son activadas por RhoA.
Se han descrito otros efectores, como los factores de andamiaje (scaffold proteins), encargados de controlar funciones celulares a través de interacciones proteína-proteína (Bishop et al. 2000, Sahai et al. 2002, Van Aelst et al. 1997).
Los miembros de la familia de Rho constituyen el grupo de reguladores más importantes de la dinámica del citoesqueleto en células eucariotas, y juegan un papel crucial en los procesos biológicos relacionados con el citoesqueleto, como la movilidad o el cambio en la forma celular (Etienne-Manneville et al. 2002). En células de mamífero, los miembros mejor caracterizados de la familia de Rho son RhoA, Rae 1 y Cdc42. En su conformación activa, son capaces de unirse a diferentes efectores, muchos de los cuales están implicados directamente en la regulación del citoesqueleto (Kozma et al. 1995, Nobes et al. 1995).
Además de su papel sobre el citoesqueleto, las proteínas Rho contribuyen a la regulación de otras funciones celulares como la regulación transcripcional o bien la proliferación y transformación celular (Pruitt et al. 2001, Sahai, et al. 2002, Jaffe et al.
2002, Besson et al. 2004, Poch et al. 2007).
En fibroblastos y células epiteliales en cultivo, RhoA, Rae y Cdc42 contribuyen a la progresión G1/S de células quiescentes, mientras que la inhibición de alguna de estas tres proteínas bloquea dicha progresión (Oison et al. 1995).
La subfamilia Rnd (round) representa un subgrupo dentro de las proteínas Rho. Está compuesta por Rnd1/Rho6, Rnd2/Rho7 y Rnd3/RhoE. Estas proteínas se caracterizan por poseer unas propiedades inusuales dentro de la familia Rho ya que carecen de actividad GTPasa intrínseca, con lo que no son capaces de unir a GDP permaneciendo constitutivamente activas.
Como se ha visto con el resto de miembros de la familia Rho, las proteínas Rnd también actúan como reguladores de la dinámica del citoesqueleto de actina. Además, también participan en la regulación del ciclo celular y apoptosis, en la trasformación mediada por oncogenes y participan en diversos aspectos del desarrollo y fisiología neuronal {Chardin. 2006).
RhoE/Rnd3 es uno de los miembros de la subfamilia Rnd de GTPasas atípicas, ya que carece de actividad GTPasa y no une GOP, por lo que se encuentra en un estado constitutivamente activo (Foster et al. 1996, Guasch et al. 1998, Chardin.
1999).
RhoE regula la organización del citoesqueleto de actina y la migración celular de una forma antagónica a RhoA (Guasch, et al. 1998). La microinyección de RhoE en macrófagos produce una reorganización de los filamentos de actina, formando extensiones similares a filopodios o pseudópodos.
El papel de RhoE como antagonista de RhoA se puede explicar por dos mecanismos moleculares: por un lado, RhoE induce pérdida de fibras de estrés y de adhesiones focales en células Cos7 y en fibroblastos vía la activación de p190-Rho GAP (Wennerberg et al. 2003). Esto produce una disminución de los niveles de RhoA GTP (activa) y bloquea la ruta de señalización. Los mutantes de RhoE incapaces de unirse a p190-Rho-GAP no inducen el fenotipo "round", demostrando así que el mecanismo de acción de RhoE es a través de dicha proteína.
Por otro lado, RhoE es capaz de unirse e inhibir a ROCK 1, el principal efector de RhoA, produciendo pérdida de fibras de estrés de actina y de adhesiones focales y aumentando la migración celular (Guasch, et al. 1998, Riento et al. 2003). La unión de RhoE a ROCK se produce a través de su región N-terminal (aa 1-420), una zona diferente a la que se une RhoA (Fujisawa et al. 1996).
Además de su efecto sobre el citoesqueleto de actina, RhoE participa en la regulación del ciclo celular, apoptosis y transformación tumoral. La inducción de la expresión de RhoE está asociada a la transformación de células epiteliales, a través de la ruta Raf-MEK-ERK (Hansen et al. 2000).
La sobreexpresión de RhoE en fibroblastos de ratón {NIH-3T3) es capaz de bloquear el ciclo celular en G1 a través de la disminución de Ciclina 01, por algún mecanismo post-transcripcional (Villalonga et al. 2004). En otro modelo, utilizando células tumorales de próstata con una alta capacidad metastática, la sobreexpresión de RhoE induce una parada del ciclo celular en G2/M. En nuestro laboratorio también hemos caracterizado el efecto de RhoE sobre el ciclo celular, utilizando células de astroglioma U87 (Poch, et al. 2007). Nuestros resultados indican que RhoE interfiere con la activación de ERK, lo que conduce a un defecto en la expresión de Ciclina 01 y en la fosforilación de Rb.
Las proteínas Rho, al estar implicadas en la regulación del citoesqueleto, juegan un papel importante en el desarrollo neuronal, en la migración neuronal, la formación y crecimiento de neuritas o en la formación y mantenimiento de las espinas dendríticas (Govek et al. 2005). Existen diversos estudios tanto in vitro como in vivo que demuestran la implicación de las proteínas Rho en la correcta formación de los circuitos neurales.
En cuanto a las proteínas Rnd poco se sabe de sus funciones a nivel del SNC. Mediante electroporación en el útero de Rnd2 constitutivamente activo y un mutante de Rnd2 inactivo, se ha demostrado que esta proteína está implicada en la migración de las células piramidales que se encuentran en la zona subventricular de la corteza embrionaria y el hipocampo (Nakamura et al. 2006). Más recientemente se ha demostrado también que Rnd2 es el mayor efector de Neurogenina 2, una proteína que controla la neurogénesis en el córtex cerebral de embriones. La sobreexpresión de Neurogenina 2 induce el aumento de Rnd2, y el efecto observado en la migración de las neuronas corticales al silenciar Rnd2 es similar al observado al silenciar Neurogenina 2. Por último, la sobreexpresión de Rnd2 recupera la migración de neuronas en las que Neurogenina 2 se ha silenciado (Heng et al. 2008).
Recientemente se ha estudiado el efecto de RhoE sobre la neuritogénesis. La sobreexpresión de RhoE en células PC12 (derivadas de un feocromocitoma de rata) induce el crecimiento de neuritas en ausencia de NGF a través de la inhibición de la vía RhoNROCK, ya que este efecto es inhibido al sobreexpresar RhoA o ROCK, e induce un aumento en los niveles de N68, un marcador de maduración neuronal (Talens-Visconti et al. 2009). Este resultado sugiere que RhoE puede desempeñar un papel importante en el desarrollo del SNC.
La utilización de ratones modificados genéticamente para el estudio de las funciones de esta familia de proteínas está cada vez más extendida, ya que los anteriores métodos no eran del todo fisiológicos.
En estos últimos años se han generado 8 ratones KO de proteínas de la familia Rho para estudiar sus funciones en un organismo vivo, con resultados muy variables. RhoA es la proteína arquetipo de la familia. Sin embargo, no existen datos en la bibliografía sobre ningún modelo animal de eliminación de su expresión, ya que no se ha conseguido generar este modelo, lo que sugiere que la proteína es esencial desde fases muy tempranas del desarrollo. Uno de los primeros genes de la familia de Rho cuya expresión se eliminó en ratones fue Cdc42. El ratón Cdc42 KO es inviable, con muerte embrionaria en estadía E7.5 (Cheng et al. 2000). El KO de Rac1 es letal en estado embrionario (Sugihara et al. 1998), pero sus tejidos han sido utilizados en múltiples estudios para dilucidar las funciones de Rac1. Los KO de Rac2, Rac3 y RhoG no muestran defectos obvios en el desarrollo, pero en diferentes líneas celulares se les han encontrado múltiples defectos (Heasman et al. 2008).
El único modelo KO de las Rho atípicas, hasta este momento, es el KO de RhoH. Los ratones RhoH KO son viables y fértiles, pero presentan defectos en la maduración de las células T (Gu et al. 2006).
En cuanto a la subfamilia de las proteínas Rnd no existen modelos in vivo, todo lo que se conoce de sus efectos es a través de la sobreexpresión de las proteínas o de mutantes derivadas de estas.
En cuanto a la expresión de RhoE in vivo, los datos obtenidos por Northem blot indican que es ubicua, siendo más destacable en el encéfalo, páncreas, timo y testículo (Nobes et al. 1998). En nuestro laboratorio hemos realizado un estudio más extenso de la expresión de RhoE en el SNC de ratones, mediante inmunohistoquímica (Ballester-Lurbe et al. 2009). La expresión de RhoE en el cerebro adulto y médula espinal es generalizada, con niveles más altos en el bulbo y la corteza. Los niveles son más altos en animales recién nacidos y va disminuyendo a lo largo del desarrollo postnatal. Específicamente, en el bulbo olfatorio se detecta en las células granulares, en la capa mitral y en los núcleos olfatorios. En el estriado, diencéfalo, mesencéfalo, protuberancia, bulbo raquídeo y la médula espinal, RhoE presenta un amplio patrón de distribución, con mayor intensidad en las motoneuronas y en algunos núcleos del tronco cerebral como el núcleo rojo o en el núcleo reticulotegmental. Por último, las células piramidales de CA1-3 y la capa de polimorfo, pero no las células granulares del giro dentado en el hipocampo también muestran un fuerte marcaje.
Con la importancia que tienen las proteínas de la familia Rho y en especial RhoE en la regulación del citoesqueleto y la importancia del citosqueleto en desarrollo del SNC y lo útiles que han resultado los ratones modificados genéticamente para estudio de las funciones de esta familia de proteínas, parece interesante la utilización de un modelo animal para intentar dilucidar las funciones fisiológicas de RhoE, principalmente a nivel del SNC.
OBJETIVOS Los resultados anteriores de nuestro laboratorio y de la bibliografía indican que RhoE no solo es importante para la regulación del citoesquelto de actina, sino que también está implicada en la regulación de la supervivencia y proliferación celular. Sin embargo, y pese a que los modelos animales son de gran valor para determinar la función fisiológica de proteínas, no hay ningún modelo in vivo para analizar la función de las proteínas Rnd y en particular, de RhoE. En este trabajo nos planteamos generar dicho modelo para caracterizar la función de RhoE in vivo. Dado el papel relevante de las proteínas Rho en el desarrollo del sistema nervioso y la implicación de RhoE en la función neuronal, nuestra hipótesis es que RhoE puede ser también importante en el desarrollo del sistema nervioso.
