Resumen de Capacidad bactericida, de disolución de tejido orgánico y biocompatibilidad del hipoclorito de sodio a diferentes ph
Objetivos: 1. Evaluar la capacidad bactericida del NaOCI al4.2% a pH 12.2, 7.5 y 6.5 frente a la bacteria Enterococcus faecalis, en dientes humanos.
2. Evaluar la capacidad de disolución de tejido pulpar del NaOCI al4.2% a pH 12.2, 7.5 y 6.5, en pulpa porcina.
3. Evaluar la citotoxicidad del NaOCI a pH 12.2, 7.5 y 6.5 a diferentes concentraciones y tiempos, en fibroblastos humanos.
Material y método: Se realizaron 3 estudios con diferente metodología, los cuales se resumen por separado a continuación.
Estudio 1: Capacidad bactericida del NaOCI al 4.2% a pH 12.2, 7.5 y 6.5 frente a la bacteria Enterococcus faecalis, en dientes humanos.
Para el estudio se utilizaron 165 dientes humanos unirradiculares extraídos almacenados en solución salina. Se instrumentaron mediante el sistema Protaper y Profile hasta un calibre 40/04. Se irrigaron con ácido cítrico al 20% e hipoclorito de sodio al 4.2% para eliminar el barrillo dentinario. Los dientes se infectaron con 10JJL de una solución que contenía 2 x 109 CFU/mL de la bacteria Enterococcus faecalis (ATCC 29212) durante 2 días. A continuación se dividieron los dientes en 5 grupos (3 experimentales y 2 control).
Grupo I: Irrigación con 0.2 ml de NaOCI 4.2% a pH 12.2 (n=43). A continuación se irrigó con 1ml de tiosulfato de sodio al 5% durante 1 minuto.
Grupo II: Irrigación con 0.2ml de NaOCI 4.2% a pH 7.5 (n=42). A continuación se irrigó con 1ml de tiosulfato de sodio al 5% durante 1 minuto.
Grupo III: Irrigación con 0.2ml de NaOCI 4.2% a pH 6.5 (n=43). A continuación se irrigó con 1ml de tiosulfato de sodio al 5% durante 1 minuto.
Control positivo: 18 conductos radiculares infectados con E.faecalis se irrigaron con tiosulfato de sodio al 5% durante 5 minutos.
Control negativo: 18 conductos radiculares sin infectar, se irrigaron con tiosulfato de sodio al 5% durante 5 minutos.
Después de la irrigación con tiosultato de sodio al 5%, se tomaron muestras de los conductos con puntas de papel de calibre 40 estériles, y se introdujeron en tubos de ensayo que contenían 5ml de BHI. Se tomaron 3 muestras por especimen. Los tubos de ensayo que contenían BHI y las puntas de papel se dejaron en el agitador térmico a 37°C durante 72h. A continuación 2 observadores examinaron los tubos para determinar la presencia de turbidez. Los resultados fueron analizados estadísticamente mediante el test de la Chi-cuadrado, se consideraron diferencias significativas cuando p<0.05.
Estudio 2: Capacidad de disolución de tejido pul par del NaOCI4.2% a diferentes pH Para el estudio de la disolución de tejido orgánico se utilizaron incisivos inferiores y superiores de cerdos jóvenes (5 meses de edad). Los dientes de cerdo se obtuvieron al sacrificar el animal en el lnstitut Català de Ciències Cardiovasculars del hospital de Sant Pau (Barcelona), con la ayuda de un botador recto y un fórceps de incisivos. El protocolo del estudio no tuvo ninguna influencia en el destino mortal de los animales. Por esta razón, esta investigación no fue clasificada como un estudio animal, y el comité ético institucional no tuvo ninguna objeción en el protocolo. Los dientes fueron conservados a 4°C en suero salino durante 48 horas. Para la obtención de las pulpas dentales se envolvieron los dientes en un dique de goma y se golpearon con un instrumento metálico para fracturar la raíz y poder extraer la pulpa completa. Se procedió a examinar las pulpas extraídas al microscopio óptico para comprobar que el tejido estaba íntegro. Las pulpas dentales se colocaron en un portaobjetos para pesarlas, medirlas y estandarizarlas con el fin de obtener nueve muestras de tejido pulpar porcino que se utilizarían en el estudio de disolución. El peso de las muestras oscilaba entre 0,026 y 0,029 g y medían aproximadamente 3 mm x 2 mm. Se prepararon nueve tubos de ensayo estériles y en cada uno se introdujeron 15 mi de la solución a evaluar y una muestra de tejido pulpar. Cada grupo tenía tres muestras de tejido. Las soluciones de NaOCI al 4.2% a diferentes pH (12.2, 7.5 y 6.5) se prepararon de la siguiente manera:
Grupo l. Irrigación con NaOCI al 4.2% (pH 12.2) Se introdujeron 15 ml de NaOCI al 4.2% de pH 12.2 en tres tubos de ensayo.
Grupo 2. Irrigación con NaOCI al 4.2% mezclado con ácido acético glacial al 99.5% (pH 7.5) Se preparó una solución de hipoclorito de sodio a pH 7.5 se colocaron 15 ml de solución en tres tubos de ensayo.
Grupo 3. Irrigación con NaOCI al 4.2% mezclado con ácido acético glacial al 99.5% (pH 6.5) Se preparó una solución de hipoclorito de sodio a pH 6.5 y se colocaron 15 ml de solución en tres tubos de ensayo.
A continuación se introdujeron las muestras de tejido pulpar en cada tubo de ensayo (que contenía 15 ml de la solución a testar) y se midió con un cronómetro (TR118, Oregon Scientific Ibérica, Madrid, España) el tiempo transcurrido hasta la total disolución del tejido pulpar. La determinación del tiempo de disolución fue realizada por tres evaluadores independientes. Cada tubo fue agitado con la ayuda de una espátula cada 30 segundos. La media de los tiempos de disolución se utilizó para juzgar la efectividad de las soluciones de NaOCL.
El efecto de los diferentes pH de las soluciones de NaOCI sobre el tejido pulpar porcino fue comparado estadísticamente utilizando el test de la T de Student. Las diferencias con una p<0.05 se consideraron estadísticamente significativas.
Estudio 3. Citotoxicidad del hipoclorito de sodio al diferentes pH, concentraciones y tiempos en fibroblastos humanos.
Se obtuvo tejido humano sano situado encima de un tercer molar impactado de un paciente, en el momento de la extracción quirúrgica en la clínica odontológica de la Universitat Internacional de Catalunya. Antes de la extracción se obtuvo la aprobación de la Comisión Científica de la Universitat Internacional de Catalunya, se le explicó al paciente detalladamente el objetivo del estudio y se le entregó una hoja de información. Una vez el paciente firmó el consentimiento informado, se procedió a la extracción de la muestra. Una vez extraída la muestra, se colocó en una solución de clorhexidina al 0.2% durante 30 segundos y a continuación se realizaron 3 lavados con solución tampón fosfato (PBS, "Phosphate-Buffered Saline"). A partir de este momento se procedió a la manipulación de la muestra en el laboratorio bajo la campana de flujo laminar. El tejido conectivo gingival se separó del epitelio bajo un microscopio óptico en condiciones estériles. Se realizaron cortes del tejido conectivo aislado, de aproximadamente 1 mm², se colocaron en una placa de cultivo de 35 mm (lwaki microplate, Scitech, Diu, Japón) dejando una distancia aproximada entre las muestras de 0.5 cm. Se dejaron secar las muestras en la placa a 37°C durante 30 minutos para permitir que se adhiriesen, a continuación se añadieron 5 ml de medio de cultivo DMEM, suplementado con 20% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 100 U/mi de penicilina G y 100 µl/ml de estreptomicina. La placa de cultivo se incubó durante treinta y tres días hasta que se observó suficiente crecimiento de fibroblastos desde los bordes de las muestras. El medio de cultivo se recambió cada tres ó cuatro días. A continuación se añadió 1 ml de tripsina al 0.1% a la placa de cultivo y se dejó actuar durante 5 minutos para desenganchar los fibroblastos de los pozos, y poder pasarlos a una placa de 10 mm. Se añadieron 3 ml de medio de cultivo para inactivar la trispsina y se pasaron las células a una placa de 10 mm que contenía 12 ml de medio de cultivo.
Para la realización del estudio se utilizaron fibroblastos que tenían de 5-9 pases, por tanto, después de cada pase, se dejaban crecer los fibroblastos hasta llegar a confluencia y se volvían a sembrar en una nueva placa.
Se procedió a sembrar las células en una placa de 24 pozos. Después de tripsinizar se colocaron en un tubo de plástico y se centrifugaron a 3000 rpm, 4°C durante 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet celular con medio de cultivo. Con la ayuda de una cámara de Neubauer y de un microscopio invertido (Oiympus CK-30) se contaron las células con el fin de poder sembrar 5 x 104 cel/ml en cada pozo.
En cada pozo se añadieron 500 ~1 de medio de cultivo y se sembraron 5 x 1 04 cel/ml, se dejaron las placas en la estufa durante 48 horas hasta llegar a confluencia. A las 48 horas se procedió a preparar los irrigantes de la misma manera que en los estudios anteriores. Se calculó la cantidad de NaOCI necesaria mediante la siguiente ecuación: ci x vi = cf x vf. Donde ci es la concentración inicial, vi es el volumen inicial, cf es la concentración final y vf es el volumen final.
En total se realizaron 14 placas. En cada placa se reservaron seis pozos para realizar los controles negativos, en los cuales no se introdujo irrigante en el medio de cultivo. Cada placa contenía NaOCI a pH 12, 7.5 y 6.5 a las siguientes concentraciones: 4.2%, 0.5%, 0.4%, 0.2%, 0.1% y 0.05%.
Para medir la viabilidad celular se utilizó el test de MTT. Una vez transcurrido el tiempo de contacto con el irrigante (15 minutos, 30 minutos o 1 hora), se introdujo un 10% de MTT en cada pozo, se incubó a 37°C durante 40 minutos en la estufa y a continuación se aspiró el sobrenadante y se añadió 400 µl de Dimetil Sulfoxide (DMSO) para parar la reacción. Se dejaron las placas en el agitador de placas durante 15 minutos para asegurar que el formazan se disolviera correctamente. A continuación se pipetearon 200 µl de solución de cada pozo de 24 a una placa de 96 pozos por duplicado.
Seguidamente, se procedió a medir la absorbancia a 595 nm con la ayuda del programa informático Magellan 4 (Tecan, España) y de un lector de absorbancia Sunrise (Tecan Sunrise Absorbance Reader, Tecan, España).
A partir de los valores de absorbancia obtenidos, se calculó la viabilidad celular dividiendo la media de la absorbancia de la muestra entre la media de la absorbancia de los controles, y multiplicando el valor resultante por 100.
Los valores obtenidos del test de Elisa fueron convertidos a porcentajes, considerando a los controles (fibroblastos no tratados con NaOCI) como el 100%. Se reportan los datos como la media ± desviación estándar.
El efecto de las diferentes concentraciones y pH de las soluciones de NaOCI sobre fibroblastos humanos fue comparado estadísticamente utilizando el test de Anova Factorial. Las diferencias con una p<0.05 se consideraron estadísticamente significativas.
Resultados:
Estudio 1: Capacidad bactericida del NaOCI al4.2% a pH 12.2, 7.5 y 6.5 frente a la bacteria Enterococcus faecalis, en dientes humanos.
Todas las muestras del control positivo mostraron turbidez, revelando así que el tiosulfato de sodio no fue tóxico para las bacterias a la concentración utilizada, y ninguno de los controles negativos mostro turbidez, demostrando el uso de una técnica aséptica durante todo el experimento. El grupo I irrigado con NaOCI a pH 12 mostró un 60.5% de desinfección, el grupo II irrigado con NaOCI a pH 7.5, un 72.1%; y el grupo III irrigado con NaOCI a PH 6.5, un 83.8%. Obtuvimos diferencias significativas entre el grupo I y III (p=0.03), pero no entre los grupos I y II (p=0.4) ni entre el ll y el lll (p=0.27).
Estudio 2: Capacidad de disolución de tejido pulpar del NaOCI4.2% a diferentes pH El grupo 1 (NaOCI pH 12.2) fue el que tardó menos en disolver el tejido orgánico (con un peso medio de 27.3 mg, tiempo de disolución medio de 7.07 minutos y velocidad de disolución media de 3.91 mg/min), seguido del grupo 2 (pH 7.5), con un peso medio de 27 mg, tiempo de disolución medio de 16.69 minutos y velocidad de disolución media de 1.61 mg/min. Ningún espécimen del grupo 3 (NaOCI 6.5) fue disuelto después de 1 hora de contacto con la solución desinfectante (peso medio 27.3 mg).
Al aplicar el test de la T de Student comprobamos que existían diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos (entre el grupo de pH 12.2 y 7.5 p=0,0015). La estadística sólo se aplicó a los grupos de pH 12.2 y 7.5, debido a que el grupo de pH 6.5 no consiguió disolver el tejido pulpar en ninguna de las muestras.
Estudio 3: Citotoxicidad del hipoclorito de sodio al diferentes pH, concentraciones y tiempos en fibroblastos humanos.
Todas las concentraciones mostraron una citotoxicidad de más del 50% de los fibroblastos expuestos a NaOCI pH 12. En todos los tiempos estudiados, el NaOCI al 4.2% pH 12 fue el que mostró mayor grado de citotoxicidad. Al realizar un análisis de la varianza observamos que habla diferencias significativas entre las diferentes concentraciones de NaOCI a pH 12.2 (p<0.05) pero no las había entre los diferentes tiempos (p=0.7).
Los resultados demuestran que al comparar la concentración de 0.05% con 0.4%, 0.5% y 4.2% había diferencias significativas, al igual que al comparar la de 0.1%, con 0.5% y 4.2%, la de 0.2% con 0.5% y 4.2% y la de 0.5% con 0.05%, 0.1%, 0.2% y 4.2%. Observamos que la concentración del 4.2% tiene diferencias significativas con todas las otras concentraciones.
Todas las concentraciones mostraron una citotoxicidad de más del 50% de los fibroblastos expuestos a NaOCI pH 7.5. En todos los tiempos estudiados, el NaOCI al 4.2% fue el que mostró mayor grado de citotoxicidad. Al realizar un análisis de la varianza observamos que había diferencias significativas entre las diferentes concentraciones de NaOCI a pH 7.5 (p<0.05) y entre los diferentes tiempos (p<0.05). Observamos que había diferencias significativas entre 15 y los 60 minutos, pero no entre los otros tiempos. Los resultados demuestran que había diferencias entre todas las concentraciones excepto entre 0.1%-0.2%, 0.1%-0.4%, 0.2%-0.4% y 0.5%-4.2%. Las concentración de 0.05% tenía diferencias con todas las otras, la concentración del 4.2% tuvo diferencias con todas las otras concentraciones excepto con la del 0.5%.
Todas las concentraciones mostraron una citotoxicidad de más del 50% de los fibroblastos expuestos a NaOCI pH 6.5. En todos los tiempos estudiados, el NaOCI al 4.2% fue el que mostró mayor grado de citotoxicidad. Al realizar un análisis de la varianza observamos que había diferencias significativas entre las diferentes concentraciones de NaOCI (p<0.05) pero no las había entre los diferentes tiempos (p=0.68). Los resultados demuestran que había diferencias significativas entre las concentraciones de 0.05%-0.5%, 0.05%-4.2%, 0.1 %-0.5%, 0.1 %-4.2%, 0.2%-4.2%.
Observamos que para el NaOCI a pH de 6.5 la concentración del 4.2% no obtuvo diferencias con todas las concentraciones.
Realizamos la comparación de las diferentes concentraciones de NaOCl (0.05%, 0.1 %, 0.2%, 0.4%, 0.5% y 4.2%), con los diferentes tiempos de exposición (15 minutos, 30 minutos y 1 hora) y con los distintos pH estudiados (6.5, 7.5 y 12.2). Al comparar los valores de viabilidad celular según el tiempo de NaOCI no encontramos diferencias significativas entre los tiempos de incubación del NaOCI con los fibroblastos. Al realizar un análisis de la varianza observamos que había diferencias significativas entre las diferentes concentraciones de NaOCI (p<0.05) y entre los diferentes pH (p<0.05) pero no los había entre los diferentes tiempos (p=0.09). Los resultados demuestran que existen diferencias significativas entre todas las concentraciones excepto entre 0.05%-0.1%, 0.1%-0.2% y 0.2%-0.4%. Observamos que las concentraciones del 0.5% y del 4.2% obtuvieron diferencias significativas con las otras concentraciones. Observamos que hay diferencias significativas entre 6.5-12.2 y entre 7.5-12.2, no en cambio entre 6.5-7.5.
Conclusiones: La actividad bactericida de la solución de NaOCI al 4.2% a pH 12.2 aumenta al acidificar la solución a pH 7.5 y 6.5.
La capacidad de disolución de tejido orgánico del NaOCI al 4.2% a pH 12.2 disminuye al acidificar la solución a pH 7.5 y 6.5.
La citotoxicidad de la solución de NaOCI a pH 12.2 aumenta al acidificar la solución a pH 7.5 y 6.5.
Las soluciones de NaOCI al 4.2% acidificadas a pH 7.5 y 6.5 son más bactericidas que la solución a pH 12, sin embargo, son también más citotóxicas y disuelven menos tejido pulpar, lo que las descarta para su uso clínico en endodoncia.
