Biotechnological applications of cross-linked enzyme crystals
- Autores: Maria Teresa Conejero Muriel
- Directores de la Tesis: Jose Antonio Gavira Gallardo (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Internacional Menéndez Pelayo (UIMP) ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Manuel García Ruiz (presid.), Alexander Edgard Suzanne van Driessche (secret.), Armando Albert de la Cruz (voc.), José Manuel Sánchez Ruiz (voc.), Rosario María Sánchez Martín (voc.)
- Materias:
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- Resumen
La biotecnología [1], ciencia empleada ya tradicionalmente desde el inicio de los tiempos en la fabricación de pan, queso o cerveza, ha experimentado una gran evolución a lo largo de la historia gracias a aportaciones de científicos como Louis Pasteur, Mendel o Watson y Crick. Al mismo tiempo, mejoras tecnológicas en microscopía, asepsia, esterilización y otros ámbitos científicos han evolucionado en paralelo favoreciendo que el siglo XX haya sido considerado como la etapa de maduración de la biotecnología. Además, la innovadora tecnología del ADN recombinante ha ayudado a ampliar aún más el potencial biotecnológico de áreas como farmacia, medicina, agricultura, medio ambiente y tratamiento de residuos. Así, dada la actual creciente evolución de la biotecnología como sector único y de sus aplicaciones en diversos ámbitos científicos, a lo largo de la presente tesis doctoral hemos tratado de desarrollar posibles aplicaciones biotecnológicas derivadas de la producción de cristales de proteínas entrecruzados. Con tal fin, el trabajo de investigación se ha desarrollado a lo largo de dos vertientes diferentes con el objeto de plantear dos posibles aplicaciones biotecnológicas.
La primera de ellas ha consistido en el uso y exploración de una batería de hidrogeles de naturaleza peptídica como soporte para la cristalización de proteínas con potenciales aplicaciones en el campo de la farmacología.
El uso de hidrogeles en biotecnología es conocido al ser un medio poroso que se presenta como posible soporte enzimático, soporte para crecimiento celular, matriz para regeneración tisular o medio para cristalización de biomacromoléculas. Con tales fines varios hidrogeles como la agarosa, sílice o hidrogeles supramoleculares ya han sido probados. Todos ellos presentan diferentes propiedades y por ende aplicaciones posibles. La agarosa por ejemplo es un hidrogel físico, compuesto por repeticiones de unidades de agarobiosa, cuyo uso se extiende desde finales de los años 1990 [2] dado su fácil manejo y preparación, elasticidad, resistencia, neutralidad y no agresión a los componentes biológicos. Los hidrogeles de sílice en cambio han sido menos empleados en biotecnología, aunque sí que se han empleado compuestos con sílice como metalisicato sódico, tetrametil ortosilicato (TMOS) o tetraetil ortosilicato (TEOS) en cristalización de compuestos inorgánicos [3]. En este caso, es un gel químico y su irreversibilidad, elasticidad y resistencia a deformación son propiedades a destacar. La incorporación de los geles supramoleculares en biotecnología, por su parte, es más reciente, siendo hoy en día investigados activamente como alternativa a los hidrogeles tradicionales. En este caso este tipo de hidrogeles se engloban dentro de los geles de tipo físicos pudiendo ser formados por polímeros naturales [4] (azucares, aminoácidos, polisacáridos, proteínas, ADN, etc.) o moléculas orgánicas sintéticas [5]. Debido a las propiedades inherentes que presentan, como son la biocompatibilidad y la biodegradabilidad, han sido empleados con múltiples aplicaciones biomédicas como liberación controlada de fármacos [6], ingeniería de tejidos [7] y reparación [8] o implicaciones en detección [9], aunque aún no han sido ampliamente estudiados en el campo de la cristalización.
En la ultima década los geles peptídicos han tomado una especial relevancia por su elevada inocuidad y biocomatibilidad, ambos parámetros controlables en función de la aplicación. Sin embargo nunca habían sido empleados en la cristalización de macromoléculas biológicas. Por ello en esta tesis hemos querido emplear diferentes proteínas, con diferente naturaleza, punto isoeléctrico y masa molecular, para demostrar por primera vez el potencial que estos tipos de geles, con diferentes características químicas y/o estructurales, puede ofrecer para la obtención de cristales de proteínas. Estos estudios nos han permitido comprobar que tales hidrogeles no son solo compatibles con el proceso de cristalización sino que además facilitan la producción de cristales de alta calidad y la generación de nuevos polimorfos. Por otro lado hemos querido investigar la influencia de estos geles peptídicos en la disolución de cristales obtenidos, un parámetro de indudable relevancia para la industria farmacéutica. De este estudio concluimos que la quiralidad de los hidrogeles no afecta a la disolución de los cristales mientras que la composición química y estructura ejercen un claro control sobre la disolución de los cristales. La obtención de estos nuevos materiales compuestos han abierto una nueva vía de investigación tanto en el campo de la biocristalogenesis como en el de la biotecnología incluyendo en este punto la industria farmacéutica. Como resultado de esta investigación dos artículos han sido publicados [10].
La segunda línea de investigación estaba encaminada a valorizar el empleo de cristales de enzimas entrecruzados como sistemas de producción de productos de elevado valor añadido o como sistemas de detección haciendo confluir la cristalización con la reciente tecnología de microfluídica.
Las enzimas son proteínas que catalizan más de 5000 tipos diferentes de reacciones bioquímicas a gran velocidad [11]. Por ello, cada vez más, presentan múltiples aplicaciones a nivel industrial y farmacéutico. Sin embargo, uno de los principales retos a seguir a nivel industrial siempre ha sido la reducción de los costes que implican la producción de enzimas o catalizadores, tanto a nivel económico como en tiempo. Por un lado la posibilidad de reusar la misma enzima en múltiples reacciones enzimáticas reduciría la cantidad de proteína a purificar. Por otro lado, una posible producción enzimática en grandes cantidades (producción en masa) también reduciría costes. En cambio, la fragilidad presentada por las enzimas en estado soluble hace que su manipulación deba ser muy delicada y que su almacenamiento o estabilidad tras su producción no sea muy larga en el tiempo. Aunque la liofilización ha sido tradicionalmente la técnica más empleada para la conservación de enzimas, la observación de ciertas modificaciones en la estructura tridimensional de las mismas, reduciendo su actividad catalítica o incluso inactivándolas totalmente [3], hicieron impulsar el estudio y explotación de técnicas de inmovilización [12] que permitieran la obtención de las características deseadas sin afectar a la actividad enzimática. Así, existen múltiples métodos de inmovilización hoy día cuyo uso depende de las características de la enzima a inmovilizar y/o de la aplicación final deseada. Existen métodos que usan soportes para realizar la inmovilización de la enzima (como son las técnicas de atrapamiento, encapsulación, adsorción o unión covalente, entre otras) y métodos de auto-inmovilización que no emplean soportes (como son la producción de complejos entrecruzados de enzimas en estado soluble, cristalino o amorfo). Dados los inconvenientes que presenta el uso de soportes para la inmovilización (reducción de productividad [13] o reducción de actividad enzimática volumétrica y específica [13b, 14], etc.), a lo largo de esta tesis hemos empleado métodos de auto-inmovilización y, más concretamente, el de producción de cristales de enzimas entrecruzados (en inglés Cross-Linked Enzyme Crystals o CLECs). Además, nuestro objetivo ha sido la combinación de enzimas auto-inmovilizadas con el campo de la microfluídica, ciencia que estudia y emplea fluidos limitados en dispositivos (microchips) de pequeño tamaño con canales de micras de tamaño. La microfluídica ha sido aplicada a campos como la nanobiocatálisis o la proteómica, pero también lo ha sido en el campo de la cristalización, donde permite una drástica reducción de la cantidad de proteína y reactivos necesarios para el proceso [15]. Tal combinación nos permitiría la formación de CLECs como sistemas mas robustos y estables (incluso en condiciones de altas temperaturas o presencia de solventes orgánicos) que la enzima soluble o inmovilizada mediante otras técnicas a la vez que consumiríamos la menor cantidad posible de enzima. Así, nuestro objetivo ha sido el diseño de un dispositivo microfluídico para producir in situ CLECs, llevar a cabo la catálisis enzimática correspondiente y, además, cuantificar el producto de interés biotecnológico producido. Para tal propuesta, hemos trabajado de manera paralela en el diseño de dos dispositivos diferentes: uno para producción de CLECs y reactor de la catálisis enzimática, denominado McCLEC; y otro para la detección espectrofotométrica del producto de interés, imitando los espectrofotómetros convencionales, denominado MPHIL, fabricando ambos en (poli)dimetilsiloxano (PDMS). En el primero de ellos, McCLEC, se ha escalado el proceso de cristalización (por método de mezcla directa de proteína y precipitante) y entrecruzado (empleando glutaraldehido) de proteínas modelo (como lisozima) y de proteínas purificadas en nuestro laboratorio (como una formamidasa de B.cereus). Posteriormente, los CLECs producidos en los dispositivos microfluídicos fueron almacenados hasta su uso (mas de un año en algunos casos) y su actividad enzimática probada bajo condiciones de reacción determinadas, en ambos casos, con proteína soluble y cristales entrecruzados fuera del dispositivo microfluídico. La robustez del sistema diseñado y producido se demostró con microchips con CLECs de la proteína modelo lisozima (CLLCs) mientras que la aplicabilidad de los mismos fue probada con los CLECs de la proteína formamidasa (CLFCs), de interés biotecnológico. En ambos casos se obtuvieron resultados enzimáticos comparables a los obtenidos en sistemas no microfluídicos, teniendo en cuenta que la cantidad de proteína en los microchips no puede ser calculada, sino solo estimada. Cabe señalar que nuestros dispositivos han mostrado una gran vida útil con usos que superaron los 20 ciclos y resistencia al almacenamiento a temperatura ambiente (un año), sin pérdidas apreciables de actividad enzimática [16].
Por otro lado, se ha diseñado un dispositivo microfluídico de múltiples caminos ópticos (MPHIL) que permite la realización de medidas ópticas en paralelo usando cantidades de muestra mínimas (3 μL). Se ha demostrado que permite determinar concentraciones de proteína, en rangos micromolares, de manera reproducible siendo posible su uso en el espectro UV-VIS y siendo asequible para cualquier laboratorio convencional dada su fácil fabricación. Además, debido a su diseño específico (con canales en serpentín), el sistema podría operar también en régimen de flujo continuo, proclamándolo como un buen candidato para aplicaciones de detección en continuo [17]. Así, la combinación, en un futuro cercano, de ambos sistemas McCLEC-MPHIL nos permitirá la creación de un sistema robusto, estable y duradero para producción de CLECs y su uso para producción y cuantificación de productos de interés biotecnológico mostrándose como una tecnología rentable para catálisis enzimáticas con aplicaciones biotecnológicas.
Conclusiones El punto de partida de este trabajo ha sido la búsqueda de posibles aplicaciones biotecnológicas de sistemas proteicos entrecruzados. Así, de acuerdo a los resultados expuestos anteriormente, en ambas vertientes son varias las conclusiones que hemos podido extraer y que serán detalladas a continuación.
En la primera parte de este trabajo hemos estudiado un nuevo tipo de hidrogeles supramoleculares, basados en péptidos de pequeña longitud, fabricados en agua (compuestos 1 y 2) así como hidrogeles basados en la familia de di-péptidos Fmoc (compuestos 3 y 4) en el campo de la cristalización de proteínas. De tal estudio hemos concluido lo siguiente: - Los cuatro hidrogeles peptídicos seleccionados son compatibles con la cristalización de proteínas siendo mediadores excelentes para producción de cristales de alta calidad (en términos de difracción).
- Los hidrogeles peptídicos probados podrían actuar como crio-protectores de cristales de proteínas, evitando el uso de aditivos necesarios antes de su difracción con rayos X bajo condiciones criogénicas.
- Es posible realizar la mezcla directa de la proteína soluble y del precursor del hidrogel (probado, por primera vez, con el compuesto 3) para crecer cristales de proteína permitiendo el escalado del proceso.
- Hidrogeles enantioméricos influencian de manera diferente la nucleación y crecimiento de una misma proteína, afectando y estabilizando diferentes polimorfismos, lo cual abre un interesante interrogante en el campo de cristalización de proteínas. Además, se han observado mayores efectos al comparar hidrogeles con propiedades químicas diferentes. - Experimentos de disolución de cristales han mostrado claramente que las fibras peptídicas se incorporan dentro de los cristales proteicos y afectan a su disolución. Se ha podido observar que la quiralidad de los hidrogeles no afecta a la disolución de los cristales mientras que su composición química sí que tiene un mayor impacto. Este hecho podría ayudarnos en la producción de nuevas formas farmacéuticas con propiedades deseadas específicas.
- Como resultado de nuestros trabajos, consideramos que la búsqueda de emparejamientos proteína-hidrogel podría ser posible para la producción de materiales de composición definida con propiedades particulares, tiempo de disolución, polimorfismos, etc., los cuales podrían ser explotados tecnológica o farmacéuticamente.
Por otro lado, hemos diseñado un dispositivo microfluídico de múltiples caminos ópticos (MPHIL) que permite la realización de medidas ópticas en paralelo con las siguientes características: - Usa cantidades de muestra y reactivos mínimas. Se ha demostrado que es adecuado para realizar mediciones de concentración de proteína pequeñas, en rango micromolar, y con un volumen de muestra necesario de tan solo 3 L.
- Mediante resultados reproducibles, se ha demostrado que se pueden determinar concentraciones de proteína de concentraciones micromolares y con un volumen de muestra de tan solo 3 μL.
- Se puede emplear para cualquier ensayo colorimétrico en el espectro UV-VIS, siendo asequible para cualquier laboratorio convencional dado su fácil fabricación con moldeado de (poli)dimetilsiloxano (PDMS).
- El diseño probado (con canales en serpentín) podría operar también en régimen de flujo continuo, proclamándolo como un buen candidato para aplicaciones de detección en continuo.
Finalmente, hemos propuesto un único sistema microfluídico (McCLEC), tanto para la producción in situ de cristales de proteínas entrecruzados como para su posterior aplicación como catalizadores de reacciones enzimáticas. Para lograr este objetivo final: - Hemos fabricado un dispositivo de PDMS diseñado específicamente para permitir la cristalización preferencial de las proteínas en los micro-pocillos.
- El sistema permite la cristalización, por método de mezcla directa, de varias proteínas y su posterior entrecruzamiento permitiendo así la producción de cristales de enzima entrecruzados (en ingles Cross-Linked Enzyme Crystals o CLECs). Además permite la adicción y extracción de reactivos o solución por todo el sistema.
- Se ha logrado un gran número de re-usos enzimáticos del sistema McCLEC mostrando una gran eficiencia del proceso junto a una importante reducción de los costes económicos.
- Los dispositivos McCLECs se han mostrado como dispositivos basados en biocatalizadores robustos, estables, duraderos y re-usables a la vez que una tecnología económica para catálisis enzimática con aplicaciones biotecnológicas muy prometedoras.
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