Especificitat i mecanisme d'(1,3), (1,4) glucanases de bacillus: mutagènesi, enzimologia i aplicació en síntesi enzimàtica
- Autores: Josep Lluís Viladot Petit
- Directores de la Tesis: Antoni Planas (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Ramon Llull ( España ) en 1999
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Carme Brosa Ballesteros (presid.), Santi Nonell Marrugat (secret.), Hugues Driguez (voc.), Alfonso Fernández Mayoralas Álvarez (voc.), Enrique Querol Murillo (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Se han estudiado los determinantes de la catálisis y la especificidad por substrato de (1,3), (1,4)-glucanasas bacterianas a nivel molecular, para establecer los principios que definen el reconocimiento enzima-carbohidratos.
El papel de los dos residuos catalíticos se ha identificado por recate químico de la actividad con nucleófilos exógenos a partir de los mutantes a alanina. El rescate químico opera de diferente forma según quien es el aminoácido esencial eliminando, con formación de productos de estereoquímica de incorporación del nucleófilo en la parte glicónica opuesta, y proporciona una prueba inequívoca del papel funcional del residuo mutado. En la reactivación con formato del mutante del nucleófilo se detecta una transiente de larga vida, que constituye el primer caso descrito en glicosidasas de mímico del intermedio covalente glicosil-enzima obtenido a partir de un azúcar no modificado. Como otras glicosidasas, las (1,3), (1,4)-glucanasas presentan actividad transglicosidasa, catalizando la transferencia de aceptores glicosídicos a dadores fluoruros de glicosilo 3-O-substituídos por formación de un enlace--(1,4).
Esta vía constituye una nueva estrategia general que se ha aplicado en la síntesis de nuevas familias de substratos de estos enzimas. A partir del análisis cinético de (1,3), (1,4)-glucanasas salvajes con series de substratos y inhibidores sintéticos se plantea un modelo de centro activo formado por seis subsitios de unión de unidades de Glcp (-IV a +II). Se evaluá la preferencia en cada subsitio por una unidad de Glcp --(1,3)- vs--(1,4)-substituida a partir de ciclos termodinámicos con familias ligandos convenientemente diseñados, y se da una interpretación de la especificidad a nivel molecular. El desarrollo y la aplicación de manera sistemática de una nueva metodología de análisis cinético de una colección de mutantes de (1,3), (1,4)--glucanasas utilizando una familia de oligosacári
