Biotechnological production of galactosides of pharmaceutical interest: enzyme screening, engineering and application

• Autores: Estela Castilla Ypas
• Directores de la Tesis: Antoni Planas (dir. tes.), Teresa Pellicer (codir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Ramon Llull ( España ) en 2018
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Laura Baldoma (presid.), Magda Faijes Simona (secret.), Alberto Marina Moreno (voc.), Regis Fauré (voc.), Pere Clapés Saborit (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioingeniería por la Universidad Ramón Llull
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Biosíntesis
      • Enzimología
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• Resumen

  • La lactosa es un disacárido de la leche producido por casi todos los mamíferos. Para su digestión debe ser hidrolizado per la enzima lactasa (EC. 3.3.1.23), que es producida por las células epiteliales del intestino delgado, dando lugar a glucosa i galactosa. Su deficiencia o baja concentración (hipolactasia) puede producir diversos síntomas como son hinchazón, dolor abdominal, flatulencias y diarrea. La evaluación de la deficiencia de la lactasa es importante en pediatría y gastroenterología por la elevada frecuencia de esta alteración genética (65%). La mayoría de los métodos de diagnóstico son invasivos y drásticos y no son adecuados para su uso en población infantil. Frente a esta situación, se desarolló un nuevo método no invasivo. Éste se basa en la administración de 4-O-β-D-galactopiranosil-D-xilose (gaxilosa), un análogo estructural de la lactosa. Este compuesto también es sustrato de la lactasa y es hidrolizado dando lugar a galactosa y xilosa. El segundo se absorbe pasivamente a través del intetsino delgado y se elimina a través de la orina donde puede ser detectado por un método colorimétrico senzillo.

    La síntesi química de la gaxilosa requiere del uso de grupos protectores y de largos y complejos pasos de síntesis para llegar a rendimientos de producción bajos (9%). La ruta biosintética utilizando galactosyltransferasas comporta dificultades técnicas y costes elevados. Por otro lado, las glicosidasas tienen la capacidad de síntesis de glicósidos por transglicosidación con costes bajos. La principal desventaja de esta metodologia son los bajos rendimientos por la actividad hidrolítica de la enzima y los problemas de purificación por la formación de regioisómeros y/u otros productos.

    La β-galactosidasa de Escherichia coli fue seleccionada, entre otras enzimas, para la producción de gaxilosa a nivel industrial. Después de varios pasos de purificación el rendimiento es del 20-23%.

    Este trabajo pretende aumentar el rendimiento de la producción de gaxilosa. Primero se modificaron las condiciones de reacción para aumentar la activitat enzimática de transglicosidación. Por otro lado, se buscó otra enzima para la producción industrial. Estudios bibliográficos y experimentales permitieron la selección de una nueva enzima capaz de sintetitzar más gaxilosa, llegando a un rendimiento del 35% utilizando 3,3 veces menos enzima (con la consecuente disminución de los costes de producción). Aunque la nueva enzima presentaba una actividad de transglicosidación mayor, la actividad hidrolítica remanente no permite aumentar el rendimento. Para modificar la actividad enzimática y aumentar la síntesis de gaxilosa se decidió modificar la enzima mediante ingeniería de proteínas (racional y aleatoria).