Determinación de nuevos sustratos de la ubiquitín ligasa SCF-FBXW7 implicados en cáncer
- Autores: Servando Giráldez Macías
- Directores de la Tesis: Francisco Romero Portillo (dir. tes.), María Dolores Tortolero García (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2014
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Diego Ruano Caballero (presid.), Francisco Ramos Morales (secret.), Rosa Farras Rivera (voc.), Marcos Malumbres (voc.), Miguel Ángel Japón Rodríguez (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Actualmente el tratamiento del cáncer se centra principalmente en destruir las células que se dividen rápidamente, ya que la división activa es una propiedad de las células tumorales. Desafortunadamente, algunas de las células normales también se dividen rápidamente, por lo que se producen múltiples efectos secundarios. Por tanto, es importante encontrar diferencias entre las células cancerosas y las células normales para desarrollar una terapia dirigida contra las primeras. Algunas terapias de este tipo van dirigidas a componentes internos y al funcionamiento de la célula cancerosa. Estas terapias utilizan pequeñas moléculas que pueden introducirse en la célula y afectar a su funcionamiento provocándoles la muerte.
La transformación tumoral se produce, en muchas ocasiones, por la estabilización de oncoproteínas o la desestabilización de supresores tumorales debido a la desregulación del sistema del proteasoma dependiente de ubiquitina (UPS). La degradación de un sustrato por el UPS se realiza en dos pasos sucesivos. Primero se unen covalentemente moléculas de ubiquitina al sustrato y, a continuación, el sustrato poliubiquitinado es reconocido y degradado por el complejo 26S denominado proteasoma. El primer paso está catalizado por tres enzimas que actúan coordinadamente: E1, que activa a la ubiquitina, E2, a la que se transfiere la ubiquitina activada, y E3 (ubiquitín ligasa), que se une a un sustrato específico y cataliza la transferencia de la ubiquitina hasta dicho sustrato, ya sea directamente o desde la enzima E2. Finalmente, el proteasoma reconoce los sustratos poliubiquitinados y los degrada en pequeños péptidos liberando la ubiquitina que puede ser reutilizada. En este campo, la mayoría de las alteraciones genéticas relacionadas con la transformación tumoral se localizan en la ligasa de ubiquitina denominada complejo SCF. El complejo SCF está formado por tres componentes invariables, RBX1, CUL1 y SKP1, y un componente variable, la proteína F-box, que se une a SKP1 y al sustrato. De especial relevancia en la formación de tumores son las F-box SKP2, FBXW7 y beta-TrCP. Por tanto, la comprensión profunda de la ubiquitinación y degradación de los sustratos, junto con el conocimiento de las funciones de las ligasas en tumorigénesis, permitirá el descubrimiento de nuevas dianas para la acción terapéutica. Este área de investigación está todavía en sus inicios, y esta Tesis ha querido contribuir a ella. Nuestro propósito general ha sido encontrar nuevos sustratos de la ubiquitín ligasa SCF-FBXW7alpha con la idea última de estudiar la implicación de éstos y de la propia ligasa en la formación de tumores, pensando en el potencial desarrollo de moléculas que pudieran alterar la estabilidad de estas proteínas.
SCF-FBXW7 ubiquitina una serie de conocidas oncoproteínas como c-MYC, ciclina E, Notch1, c-JUN o MCL1, lo que hace que esté implicada en el control de diversos procesos celulares, tales como la progresión del ciclo celular, la proliferación, la respuesta a los daños en el ADN, etc. Además, dado que se han encontrado niveles reducidos de FBXW7 o mutaciones de pérdida de función en una amplia gama de cánceres humanos, se considera generalmente que FBXW7 es un supresor tumoral.
Nosotros hemos utilizado una doble estrategia consistente en un escrutinio en levaduras mediante el sistema de doble híbrido, y en experimentos de coinmunoprecitación y análisis de los complejos por espectrometría de masas, para identificar nuevas proteínas que interaccionen con FBXW7alpha. Así, identificamos una serie importante de proteínas que se asociaban, mediante una o las dos técnicas, a la F-box. Posteriormente analizamos, por ensayos de coinmunoprecipitación específicos tanto directos como recíprocos, las interacciones de esos potenciales sustratos de la ligasa con FBXW7alpha y elegimos hnRNP K, p53 y especialmente PLK1 para su estudio ulterior.
hnRNP K es una proteína multifuncional que está implicada, entre otras funciones, en la regulación de la organización estructural de la cromatina, el transporte y la traducción del ARN, la transducción de señales y la reparación del ADN. Las células en división tienen una expresión elevada de hnRNP K, lo que sugiere que la proteína tiene una función pro-proliferativa. De acuerdo con esta observación, una gran diversidad de tumores presentan altos niveles de hnRNP K. Nosotros hemos determinado que SCF-FBXW7alpha ubiquitina tanto in vitro como in vivo y provoca la degradación de hnRNP K en interfase, ocurriendo esto probablemente en el núcleo celular, de tal manera que si no se degrada, la proteína se transloca al citoplasma. Estos datos, junto con los de otros autores, sugieren que esa localización aberrante evitaría la traducción de ARNm de genes supresores de tumores contribuyendo al desarrollo del cáncer.
p53 es el gen que aparece más frecuentemente mutado en los cánceres humanos. Funciona como un sensor de la integridad del genoma y es activado por diferentes formas de estrés celular, sobre todo, los daños en el ADN. Actúa deteniendo el ciclo celular, para dar tiempo a la reparación de los daños, o induciendo apoptosis, para evitar la división de las células dañadas. p53 ejerce sus funciones activando la transcripción de múltiples genes diana. Nosotros hemos comprobado que FBXW7alpha no solo interacciona con p53 e induce su ubiquitinación tanto in vitro como in vivo, sino que en condiciones normales le provoca una pequeña, pero reiterativa, degradación vía proteasoma. Sin embargo, el papel más importante de SCF-FBXW7alpha respecto a p53 es que induce su degradación tras daños en el ADN. Teniendo en cuenta que p53 activa la expresión de FBXW7 y que nuestros datos muestran que éste media la ubiquitinación y degradación del primero, podemos concluir que entre estas dos proteínas se produce un bucle de autorregulación negativa. Además, nuestros datos nos llevan a sugerir que la función de FBXW7alpha es colaborar en la recuperación de los niveles basales de p53 tras repararse los daños en el ADN.
Por último, PLK1 es una quinasa de serina/treonina que tiene un papel esencial en la división celular, pero que también está implicada en otras funciones como la replicación del ADN, la regulación de p53 o la recuperación de las células tras daños en el ADN en la fase G2 del ciclo celular. En esta Tesis, hemos puesto de manifiesto que PLK1 es un nuevo sustrato de SCF-FBXW7alpha, ya que interacciona con la F-box del complejo, que a su vez la ubiquitina provocando su degradación por el proteasoma. Además, identificamos un nuevo CPD (sitio de unión a FBXW7) en PLK1, que está conservado desde levaduras hasta humanos. La mutación de este sitio impide la unión de FBXW7alpha a PLK1, estabilizando la proteína. Asimismo, demostramos que la sobreexpresión de FBXW7alpha provoca in vivo la degradación de PLK1 en G1 y S de células control, y en S tras daños en el ADN. También hemos comprobado que tanto la sobreexpresión de FBXW7alpha como la radiación UV evitan el ensamblaje de proteínas en la cromatina para formar los complejos de prerreplicación, necesarios para la síntesis del ADN, con la consiguiente reducción de la proliferación celular. Por tanto, concluimos que la degradación de PLK1 inducida por SCF-FBXW7alpha modula el punto de control de la fase S tras daños en el ADN.
En conjunto, hemos identificado nuevos sustratos de SCF-FBXW7alpha que pueden estar implicados en la formación de tumores. A partir de aquí, podemos correlacionar la ligasa con los nuevos sustratos en tumores de pacientes para ratificar el interés de éstos y buscar moléculas que afecten a la degradación de estas nuevas dianas.
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