Degradación de compuestos aromáticos y alicíclicos en la bacteria Azoarcus sp. CIB, y sus aplicaciones biotecnológicas

• Autores: David Sanz Mata
• Directores de la Tesis: Eduardo Díaz Fernández (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2020
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: José Berenguer Carlos (presid.), Marta Martín Basanta (secret.), Eduardo Santero (voc.), Víctor de Lorenzo Prieto (voc.), Silvia Marqués Martín (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Microbiología
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen
  • español

    La β-proteobacteria Azoarcus sp. CIB es un organismo modelo para el estudio de la degradación anaeróbica/aeróbica de compuestos aromáticos. En esta tesis doctoral se ha profundizado en el conocimiento de dichas rutas metabólicas, ampliando la capacidad degradadora de la cepa CIB a nuevos compuestos contaminantes (o-ftalato) y estudiando el metabolismo de compuestos alicíclicos, como el ciclohexano carboxilato (CHC), cuya degradación converge con la de los compuestos aromáticos a nivel de la ruta baja de β-oxidación de ácidos dicarboxílicos alifáticos (catabolón del (hidroxi)pimelil-CoA).

    El primer objetivo ha consistido en el desarrollo de una cassette pht (a partir de los genes de Aromatoleum aromaticum EbN1) que incluye tanto los genes catabólicos necesarios para el metabolismo anaeróbico periférico del o-ftalato hasta benzoil-CoA, como los genes phtTaTb, que codifican el primer transportador tipo TAXI-TRAP que se describe para el transporte de o-ftalato y que son esenciales para el crecimiento anaeróbico de la cepa CIB recombinante en o-ftalato. Inesperadamente, la ruta pht también se ha demostrado funcional en presencia de oxígeno, y se ha confirmado la consiguiente mineralización del benzoil-CoA generado a través de la ruta aeróbica híbrida box. La expresión de la cassette pht en la bacteria Cupriavidus necator H16 ha permitido el desarrollo de un biocatalizador capaz de revalorizar o-ftalato hacia la producción de polihidroxibutirato (PHB), lo que supone un abordaje pionero para el reciclado de sustancias plastificantes que son también contaminantes emergentes.

    En el segundo objetivo se han caracterizado los genes bad implicados en el metabolismo aeróbico/anaeróbico del CHC en Azoarcus sp. CIB. A diferencia de lo descrito en bacterias fotótrofas o en anaerobios estrictos degradadores de compuestos aromáticos, la ruta bad de bacterias desnitrificantes, como la cepa CIB, no converge con la ruta central anaeróbica del benzoil-CoA (ruta bzd). Se ha caracterizado la regulación específica del cluster bad de Azoarcus sp. CIB, que está mediada por el represor transcripcional BadR y la molécula inductora CHC-CoA. La presencia de clusters bad con una organización génica similar en diversas proteobacterias sugiere una regulación transcripcional conservada en todos ellos y revela que la capacidad para metabolizar CHC está más extendida de lo que inicialmente se había sospechado. El desarrollo de una cassette bad y su expresión en Escherichia coli para la producción de pimelil-CoA (un precursor de biotina) a partir de CHC es un ejemplo del valor biotecnológico de los estudios realizados.

    En el tercer objetivo de la tesis se han identificado los genes aab implicados en la ruta baja de β-oxidación del (hidroxi)pimelil-CoA derivado de la ruta central anaeróbica del benzoil-CoA (ruta bzd) y de la ruta del CHC en Azoarcus sp. CIB. Un segundo cluster de β-oxidación similar al anterior (genes pim) es el encargado de la degradación de pimelato en la cepa CIB. Aunque los clusters aab y pim se inducen específicamente en presencia de sus diferentes sustratos, la inactivación de uno de ellos se compensa con la inducción del otro. La caracterización del catabolón del (hidroxi)pimelil-CoA para el metabolismo de compuestos aromáticos (anaeróbico), alicíclicos (CHC) y alifáticos (pimelato) ha permitido la construcción de diferentes cassettes metabólicas que, combinadas con los genes bad, permiten expandir la degradación del CHC y pimelato a huéspedes heterólogos, e.g. Pseudomonas putida, y pueden ser de gran interés biotecnológico para la síntesis de nuevos biopolímeros

  • English

    The β-proteobacteria Azoarcus sp. CIB is a model organism for the study of the anaerobic/aerobic degradation of aromatic compounds. In this doctoral thesis, the knowledge on these metabolic pathways has been expanded, broadening the degrading capacity of the CIB strain over new contaminant compounds (PA) and studying the metabolism of alicyclic compounds, such as cyclohexane carboxylate (CHC), whose degradation converge with that of aromatic compounds at the level of the lower pathway of aliphatic dicarboxylic acids β-oxidation (the (hydroxy)pimeloyl-CoA catabolon).

    The development of a pht cassette (from the Aromatoleum aromaticum EbN1 genes) was the first objective of this work. This cassette includes both the catabolic genes needed for the peripheral anaerobic metabolism of PA to benzoyl-CoA, and the genes phtTaTb that encode for the first TAXI-TRAP transporter described for the transport of PA and that are essential for the anaerobic growth of the recombinant CIB strain in PA. Unexpectedly, the pht pathway has been demonstrated to be functional in the presence of oxygen, and it has been confirmed the subsequent mineralization of the benzoyl-CoA generated through the box hybrid aerobic pathway. The expression of the pht cassette in the bacteria Cupriavidus necator H16 has allowed us to develop a biocatalyst able to valorize PA for polyhydroxybutyrate (PHB) production. This represents a pioneer approach for the recycling of plasticizing substances that are also emerging contaminants.

    The characterization of the bad genes involved in the aerobic/anaerobic metabolism of CHC in Azoarcus sp. CIB was the second objective of this thesis. Unlike what was described for phototroph bacteria or strict anaerobic degraders of aromatic compounds, the bad pathway of denitrificant bacteria, such as the CIB strain, does not converge with the central anaerobic pathway of benzoyl-CoA (bzd pathway). The specific regulation of the Azoarcus sp. CIB bad cluster, mediated by the BadR transcriptional repressor and the CHC-CoA inductor molecule, has been characterized. The presence of bad clusters with a similar genetic organization in diverse proteobacteria suggests a conserved transcriptional regulation and reveals that the capacity to metabolize CHC is more widespread than what it was initially thought. The development of a bad cassette and its expression in E. coli to produce pimeloyl-CoA (a biotin precursor) from CHC is an example of the biotechnological value of these discoveries.

    The third objective of this work was to identify the aab genes, involved in the lower pathway for the β-oxidation of (hydroxy)pimeloyl-CoA, which is derived from the anaerobic central pathway of benzoyl-CoA (bzd pathway) and the bad pathway in Azoarcus sp. CIB. A second β-oxidation cluster (pim genes), that is similar to the previous one, is responsible for the degradation of pimelate in the CIB strain. Although the aab and pim clusters are specifically induced in the presence of their diverse substrates, the inactivation of one of them is compensated with the induction of the other. The characterization of the catabolon of (hydroxy)pimeloyl-CoA for the metabolism of aromatic (anaerobic conditions), alicyclic (CHC) and aliphatic (pimelate) compounds has allowed us to construct diverse metabolic cassettes that, in combination with the bad genes, allow to widespread CHC and pimelate degradation to heterologous hosts, such as Pseudomonas putida, and that can be of great biotechnological interest for the synthesis of new biopolymers