Deciphering in vivo reprogramming and its rejuvenating potential

• Autores: Dafni Chondronasiou
• Directores de la Tesis: Manuel Serrano Marugán (dir. tes.), José manuel Cuezva Marcos (tut. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2020
• Idioma: inglés
• Número de páginas: 165
• Títulos paralelos:
  • Descifrando la reprogramación in vivo y su potencial de rejuvenecimiento
• Tribunal Calificador de la Tesis: Amparo Cano (presid.), Francisco X Real (secret.), Meritxell Rovira Clusellas (voc.), Alejandro Ocampo Mendez (voc.), Manuel Collado Rodríguez (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid
• Calificación: Sobresaliente Cum Laude
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen
  • español

    La manipulación de la identidad celular a través de la reprogramación ha sido uno de los avances científicos más relevantes de los últimos años. La aportación más destacada al campo fue la de Yamanaka, quien por primera vez obtuvo células madre pluripotentes inducidas a partir de células diferenciadas mediante la expresión ectópica de cuatro factores de transcripción, Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc, también conocidos como OSKM. Nuestro laboratorio ha demostrado que la expresión transitoria de estos cuatro factores de Yamanaka promueve la formación de teratomas en ratones, demostrando la existencia de reprogramación in vivo. Nuestro interés se centraba en discernir los pasos intermedios de desdiferenciación celular, inducidos por la expresión de OSKM in vivo con anterioridad a la adquisición de la pluripotencia. Para ello enfocamos el estudio en el páncreas, puesto que es el órgano con mayor eficiencia de reprogramación in vivo. Aquí demostramos que la reprogramación in vivo lleva a la pérdida de la identidad acinar en el páncreas y a la adquisición de una morfología tubular atípica que difiere de los ductos pancreáticos y de los ductos metaplásticos producidos durante una pancreatitis. Es destacable que los túbulos atípicos inducidos por OSKM se caracterizan por la presencia de keratina 14 (KRT14), una proteína que no está normalmente presente en el páncreas, a excepción de infrecuentes cánceres pancreáticos de células escamosas. Además, estas células atípicas positivas para KRT14 se observan en varios tejidos tras la expresión de OSKM, siendo Klf4 el principal propulsor de su aparición, al menos en fibroblastos. La secuenciación del transcriptoma de células individuales que han sido reprogramadas parcialmente confirma la presencia de múltiples cambios en identidad celular, tanto en células acinares como ductales. Finalmente, células derivadas de páncreas parcialmente reprogramados son capaces de formar organoides in vitro, cuyo perfil transcripcional se asemeja a estadios embrionarios primitivos.

    En un enfoque experimental similar, hemos investigado el potencial de células parcialmente reprogramadas para rejuvenecer tejidos. Para ello, la expresión de OSKM fue activada de manera transitoria y posteriormente inactivada para permitir la recuperación de la homeostasis histológica. Resulta interesante que la activación transitoria de OSKM en ratones envejecidos promueve el rejuvenecimiento de alteraciones transcripcionales asociadas al envejecimiento. Además, a nivel epigenético, la expresión transitoria de OSKM revierte los cambios en aquellas regiones, incluyendo promotores y enhancers, cuyo estado de metilación se altera con el envejecimiento, poniendo de manifiesto su efecto beneficioso en el rejuvenecimiento.

    En conclusión, entender la plasticidad celular inducida por la expresión transitoria de OSKM es de gran importancia, puesto que leves desequilibrios pueden inducir tanto a la remodelación tisular, como a la formación de tumores o bien al rejuvenecimiento

  • English

    The manipulation of cell fates through reprogramming is one of the most exciting advances in recent years. The most striking breakthrough in the field occurred when Yamanaka first illustrated the possibility to convert differentiated cells into pluripotent stem cells by the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc or OSKM. Our laboratory has demonstrated that transient expression of these four Yamanaka factors leads to teratoma formation in mice indicative of in vivo reprogramming. We were interested in deciphering the intermediate events of de-differentiation induced by OSKM in vivo before reaching pluripotency. For this purpose, we focused on the pancreas which we found to be the organ with the highest reprogramming efficiency in vivo. We demonstrate that in vivo reprogramming leads to the loss of pancreatic acinar identity and the acquisition of an atypical tubular morphology different from normal pancreatic ducts or from the metaplastic ducts produced by pancreatitis. Interestingly, the OSKM-induced atypical tubules are characterized by the presence of keratin 14 (KRT14), a protein that it is normally absent from pancreas, except in the context of rare squamous pancreatic cancers. Moreover, these atypical KRT14-positive cells emerge in many different tissues and primary cells upon OSKM activation, with Klf4 overexpression being the driving force in their emergence, at least in fibroblasts. Single cell RNA sequencing of partially reprogrammed pancreas confirms the presence of extensive changes in cell identity both in acinar and ductal cells. Finally, cells derived from partially reprogrammed pancreas efficiently form organoids in vitro with a transcriptional profile that resembles primitive embryonic stages.

    In a complementary experimental approach, we have investigated the potential of partial reprogramming to rejuvenate tissues. For this, OSKM was transiently induced and then switched off to allow the restoration of normal histology. Interestingly, we found that transient OSKM activation in old mice rejuvenates transcriptomic alterations associated to aging.

    Moreover, at an epigenetic level, OSKM transient expression reverses the methylation status of some age-associated differentially methylated regions, including promoters and enhancers, highlighting its beneficial window towards rejuvenation.

    Overall, unraveling the cellular plasticity induced by transient OSKM activation is of great importance considering that a shift in equilibrium could lead either to extensive tissue remodeling and tumor formation, or to rejuvenation