Identificación y estudio de genes simbióticos de Sinorhizobium fredii HH103 previamente no caracterizados

• Autores: Pilar Navarro Gómez
• Directores de la Tesis: José María Vinardell González (dir. tes.), Sebastián Acosta Jurado (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2020
• Idioma: español
• Número de páginas: 278
• Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Javier Ollero Márquez (presid.), Irene Jiménez Guerrero (secret.), Francisco Javier Lloret Romero (voc.), Marta Martín Basanta (voc.), Pablo del Cerro Sánchez (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica por la Universidad de Sevilla
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Simbiosis
  • Ciencias agrarias
    • Fitopatología
      • Bacterias
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Idus
• Resumen

  • En la relación simbiótica que tiene lugar entre plantas leguminosas y rizobios fijadores de nitrógeno es necesaria una comunicación recíproca entre ambos organismos en la que intervienen señales químicas producidas por la planta y la bacteria. Sinorhizobium fredii HH103 es un rizobio simbionte de la soja que presenta un amplio rango de hospedador (Margaret et al., 2011; Vinardell et al., 2015). Los flavonoides exudados por la raíz de la leguminosa inducen la expresión de los genes simbióticos rizobianos a través de la activación de la proteína bacteriana NodD. La proteína reguladora NodD se expresa constitutivamente y codifica un activador transcripcional de tipo LysR que, en presencia de flavonoides específicos, reconoce y se une a nod boxes (NB), secuencias promotoras localizadas aguas arriba de los genes de nodulación, desencadenando su transcripción. Las NB controlan la expresión de genes involucrados en la producción de señales moleculares (factores Nod) necesarias para los pasos iniciales de la interacción simbiótica, así como para la transcripción del gen ttsI, cuyo producto va a reconocer y unirse a tts boxes (TB), induciendo la secreción de proteínas (efectores) a través del sistema de secreción de tipo 3 (T3SS). Estas proteínas efectoras modulan la respuesta defensiva de la planta y son importantes para determinar la compatibilidad entre ambos simbiontes. También hay varios genes de HH103 con función desconocida y cuya expresión es dependiente de NB. Además, hay grupos de genes en HH103 que se expresan diferencialmente en presencia de genisteína (flavonoide inductor de los genes de nodulación en HH103) pero que no están controlados por una NB o una TB (Pérez-Montaño et al., 2016b). Actualmente, muchos de estos genes de S. fredii HH103 ya han sido estudiados. Sin embargo, todavía hay genes simbióticos importantes que continúan sin ser caracterizados. El estudio de algunos de estos genes ha sido uno de los objetivos principales de esta Tesis para profundizar en su posible papel simbiótico y aumentar el conocimiento sobre los determinantes moleculares que permiten que esta bacteria establezca simbiosis con un elevado número de leguminosas. Más específicamente, hemos estudiado los siguientes genes: - psfHH103d_448 y psfHH103d_208 cuya expresión es controlada por la NB13 y 17, respectivamente (objetivo 1). El gen psfHH103d_448 codifica una proteína hipotética no presente en otros rizobios, incluso en otras estirpes de S. fredii. Contiene un dominio receptor, lo que sugiere su pertenencia a un sistema de dos componentes, en el que participan una proteína histidina quinasa (HK) y una proteína reguladora de respuesta (RR). La HK, regulada por un estímulo ambiental, se autofosforila en un residuo de histidina creando un grupo fosforilo altamente energético que es transferido a un residuo de aspartato en la RR. La fosforilación de esta proteína induce un cambio conformacional en su dominio regulador lo que resulta en la activación de su dominio efector desencadenando así una respuesta (Stock et al., 2000). El producto de psfHH103d_448 podría ser el componente RR, pero carece de dominio conocido de unión a ADN. El gen psfHH103d_208 codifica una proteína con un dominio conservado denominado casete de unión a ATP, lo que indica que es miembro de la familia de transportadores de tipo ABC (del inglés, ATP-binding cassette). Esta familia de transportadores comprende una superfamilia grande y diversa de transportadores de membrana que están presentes en todos los dominios de la vida. En bacterias, catalizan reacciones de transporte. Por ejemplo, la absorción de micronutrientes de alta afinidad y la exportación de compuestos citotóxicos (contribuyendo a la resistencia de la bacteria a medicamentos) (Locher, 2016). En esta Tesis hemos visto que la inactivación de cualquiera de estos dos genes no tiene efecto en la eficiencia simbiótica de HH103 con soja. - Cinco genes localizados en el plásmido simbiótico y regulados por la NB1 (objetivo 2). Esta caja controla la expresión de psfHH103d_373 a psfHH103d_370, los cuales podrían estar implicados en síntesis de triterpenoides pentacíclicos llamados hopanoides. La inactivación de sus genes ortólogos en Bradyrhizobium sp. y Bradyrhizobium diazoefficiens afecta negativamente a la supervivencia bacteriana en condiciones de estrés y a su capacidad simbiótica con sus leguminosas hospedadoras. El hecho de que en S. fredii HH103 estos genes se induzcan por flavonoides y NodD1 sugirió que los hopanoides podrían ejercer un papel protector durante la simbiosis. Sin embargo, en esta Tesis hemos visto que HH103 no produce hopanoides en presencia de flavonoides y que la inactivación de varios de estos genes tiene poco efecto en la simbiosis con soja. - Un posible operón localizado en el cromosoma y constituido por flgJ (codifica una proteína flagelar) y dos genes que codifican proteínas hipotéticas conservadas, SFHH103_00347 y SFHH103_00348 (objetivo 3). En esta Tesis hemos visto que la expresión de estos genes es dependiente de NodD1 y TtsI a través de una TB imperfecta localizada aguas arriba de flgJ, pero que su expresión también se ve ligeramente influenciada por SyrM debido a la presencia de una SyrM box (SB) también imperfecta. La inactivación de cualquiera de estos genes suprime totalmente la movilidad de tipo swimming, y en el caso de SFHH103_00347 y SFHH103_00348, también la movilidad en superficie, la cual es dependiente de genisteína en HH103. Los mutantes en flgJ y en SFHH103_00347 carecen de flagelo. La inactivación de flgJ disminuye parcialmente la movilidad en superficie indicando que, además del swarming, otros mecanismos son responsables de este tipo de movilidad. En simbiosis, la inactivación de estos genes tiene distintos efectos en función del gen mutado y de la leguminosa hospedadora estudiada. Finalmente, en trabajos previos, nuestro grupo mostró que la proteína NodD1 es el regulador principal en presencia de genisteína de la expresión génica de HH103, pero otros genes reguladores tienen un papel en la modulación de la expresión del regulón nod. El segundo objetivo principal de esta Tesis (objetivo 4) ha sido continuar con la caracterización del complejo circuito regulador que depende de flavonoides en S. fredii HH103. Para este propósito, hemos integrado los datos de RNAseq de mutantes de HH103 afectados en diferentes reguladores transcripcionales, y hemos usado métodos alternativos (qPCR, ensayos β-galactosidasa) para analizar la expresión de esos reguladores en distintas condiciones (presencia o ausencia de flavonoides, presencia o ausencia de otros reguladores). Hemos visto la importancia de los reguladores transcripcionales TtsI, NodD2, NolR y SyrM como “elementos secundarios” del regulón nod, conduciendo a un fine tuning de diferentes características bacterianas involucradas en la transición de vida libre al estado simbiótico: factores Nod y producción de exopolisacáridos, liberación de proteínas efectoras a través del T3SS simbiótico, movilidad en superficie.