Desarrollo de nuevas tecnologías en proteómica de segunda generación y su aplicación al estudio de cambios dinamicos relacionados con la disfuncion cardivascular

• Autores: Horacio Serrano Rivera
• Directores de la Tesis: Jesús Vázquez (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2008
• Idioma: español
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• Resumen

  • ÍNDICE 1. SUMMARY ..................................................................... 8 2. ABREVIATURAS ............................................................ 9 3. INTRODUCCIÓN ............................................................. 11 3.1. Precondicionamiento isquémico y disfunción cardiovascular........................................... 11 3.1.1. La isquémia cardiaca y el daño por reperfusión ................................................................. 11 3.1.2. Precondicionamiento del miocardio ................................................................................... 11 3.1.3. La Conexina 43 (Cx43) ......................................................... 12 3.2. La proteómica actual ............................................................ 13 3.2.1. Proteómica clásica: Escuela Europea ................................................................................. 13 3.2.2. Proteómica de Segunda Generación ................................................................................... 14 3.2.3. Identificación masiva de proteínas ..................................................................................... 15 3.2.4. Indicador estadístico no paramétrico: Probability Ratio (pRatio) ...................................... 16 3.3. La proteómica de expresión diferencial .............................................................................. 17 3.3.1. Marcajes Químicos: .......................................................... 17 3.3.1.1. "Isotope-Coded Affinity Tags"(ICAT) ...................................................................... 17 3.3.1.2. Isotope Tangging Reagents for Relative and Absolute Quantificaction (iTRAQ) ...... 18 3.3.2. Marcaje Metabólico:"Stable Isotope Labeling with amino acid in Cell culture"(SILAC) 19 3.3.3. Marcaje enzimático con 18O ............................................................................................... 19 4. OBJETIVOS ................................................................ 21 5. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................ 22 5.1. Reactivos .................................................................................. 22 5.2. Modelos de precondicionamiento isquémico del miocardio .............................................. 22 5.3. Aislamiento de mitocondrias ..................................................... 22 5.4. Electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ........................... 23 5.5. Digestión en gel y marcaje isotópico .................................................................................... 23 5.5.1. Cortes de gel .................................................................... 23 5.5.2. Digestión tríptica en gel .......................................................................... 23 5.5.3. Marcaje enzimático con 16O/18O...................................................................................... 24 5.6. Configuración y acoplamiento de un sistema de cromatografía líquida de alta presión (HPLC), con un inyector de muestras automático y una trampa iónica lineal MS/MS .. 25 5.7. Análisis por espectrometría de masas ................................................................................. 28 5.7.1. Identificación y cuantificación relativa de péptidos de conexina 43 y conexina 32 mediante la técnica SMIM .......................................................................... 28 5.7.2. Identificación y cuantificación masiva de proteínas .......................................................... 29 5.7.3. Modelo Estadístico ......................................................................... 30 5.7.4. Cuantificación de péptidos y análisis estadístico ............................................................... 30 5.7.5. Cálculo del peso estadístico del ajuste ............................................................................... 31 5.7.6. Cálculo de la media ponderada y las varianzas a nivel de scan, péptido y proteína. .......... 31 ÍNDICE 7 6. RESULTADOS ........................................................................ 34 6.1. Puesta a punto de un sistema para el análisis masivo de proteomas por espectrometría de masas ..................................................................................... 34 6.2. Estudio de la distribución mitocondrial de las conexinas 43 y 32 ..................................... 36 6.2.1. Identificación específica de la conexina 43 en membrana mitocondrial en cardiomiocitos de rata ......................................................................................... 36 6.2.2. Estudio de la distribución mitocondrial de la conexina 32 en un modelo animal de ratones Cx43KI32 ........................................................................... 40 6.3. Identificación masiva de proteínas de membrana mitocondrial utilizando SDS-PAGE y digestión en gel ............................................................................. 42 6.4. Cuantificación masiva de proteínas de membrana mitocondrial utilizando SDS-PAGE, digestión en gel y marcaje isotópico con 18O: experimento de prueba ............................ 44 6.5. Estudio diferencial del proteoma de membrana mitocondrial de rata en respuesta a un modelo de precondicionamiento isquémico ....................................... 47 7. DISCUSIÓN ................................................................ 60 7.1. Innovaciones tecnológicas para el estudio del proteoma de membrana mitocondrial .... 61 7.2. Implicaciones de los resultados con Cx43 y Cx32 en el precondicionamiento isq.......................................................... 64 7.3. Implicaciones fisiológicas de los cambios en los niveles de proteínas detectados en el precondicionamiento isquémico................................................................. 64