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Campylobacter coli: Sensibilidad antibiótica, bases moleculares de la resistencia y epidemiología molecular

  • Autores: Ana Ruiz Castillo
  • Directores de la Tesis: Javier Aznar (dir. tes.), María José Torres Sánchez (dir. tes.)
  • Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2020
  • Idioma: español
  • Número de páginas: 156
  • Tribunal Calificador de la Tesis: Manuel Antonio Rodríguez Iglesias (presid.), María Carmen Conejo Gonzalo (secret.), Olaf Neth (voc.), Verónica González Galán (voc.), Fátima Galán Sánchez (voc.)
  • Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica por la Universidad de Sevilla
  • Materias:
  • Enlaces
    • Tesis en acceso abierto en: Idus
  • Resumen
    • “Campylobacter coli: Sensibilidad antibiótica, bases moleculares de la resistencia y epidemiología molecular” INTRODUCCIÓN Las células del género Campylobacter son bacilos con forma curvada, en forma de S o espiral. Son gram negativos y no forman esporas. Son típicamente móviles, con un movimiento característico en sacacorchos realizado gracias a un flagelo polar sin vaina en uno o ambos extremos de la célula.

      Campylobacter y los microorganismos relacionados crecen mejor en una atmósfera que contiene entre un 5% y un 10% de oxígeno, por lo que se consideran microaerófilos y obtienen la energía de los aminoácidos y de los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La actividad oxidasa está presente en casi todas las especies.

      Todos los Campylobacter crecen a 37ºC, sin embargo C. jejuni y C. coli lo hacen de forma óptima a 42ºC. Al tratarse de las principales especies causantes de enfermedad, los laboratorios utilizan esta termotolerancia para optimizar su aislamiento, así como medios selectivos basados en sangre con antibióticos, mejorando el aislamiento de C. jejuni y C. coli. Habitualmente no se usan los medios de enriquecimiento debido a la alta carga bacteriana excretada en las heces de una persona enferma.

      Tras la incubación durante 48 – 72 horas, se procede a la identificación mediante pruebas bioquímicas y moleculares, principalmente con las pruebas de oxidasa, catalasa, hidrólisis de hipurato (diferenciación entre C. jejuni y C. coli) así como el empleo de espectrometría de masas (MALDI-TOF), que ha supuesto un gran avance en la identificación bacteriana.

      IMPORTANCIA CLÍNICA Manifestaciones gastrointestinales  Gastroenteritis C. jejuni y C. coli son causantes de diarrea en humanos. La enteritis aguda es la presentación más frecuente. Tras un periodo prodrómico con fiebre, cefalea, mialgia y decaimiento de 12 a 24 horas, comienzan los síntomas intestinales, que pueden ir desde heces sueltas a una gran diarrea acuosa o sanguinolenta, pudiendo presentar cualquier paciente todo el espectro. Los síntomas duran, de media, 6 días, aunque pueden variar de un día a más de una semana. Los síntomas generalmente comienzan a las 24 – 72 horas tras la ingestión de alimentos contaminados, aunque puede tardar más si la dosis infectiva ha sido baja.

      Aunque la infección puede ocurrir a cualquier edad, es más frecuente en los niños pequeños de 1 a 4 años, así como en los adultos jóvenes (de 15 a 24 años). La infección suele ser más común en los meses de verano y C. coli, aunque es menos prevalente que C. jejuni, puede suponer hasta el 25% de las gastroenteritis causadas por especies de Campylobacter.

       Otras manifestaciones gastrointestinales En la Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII), el impacto de patógenos incluyendo Campylobacter sigue actualmente en debate.

      Las dos alteraciones más importantes de la función gastrointestinal son el síndrome del intestino irritable y la dispepsia funcional, que son formas post-infecciosas que se desarrollan de novo a pesar del aclaramiento del agente causal, y el mecanismo por el que se produce es desconocido.

      Otras manifestaciones gastrointestinales en que se está encontrando relación con ciertas especies de Campylobacter son el reflujo gastroesofágico, la esofagitis de Barrett, la gingivitis crónica, periodontitis y otras enfermedades de la cavidad bucal así como una posible relación aún en estudio entre el cáncer colorrectal y determinados perfiles bacterianos de la microbiota fecal entre los que se incluye Campylobacter.

      Manifestaciones extraintestinales La bacteriemia y la septicemia son las manifestaciones extraintestinales más frecuentes, asociados con C. jejuni, C. coli y C. fetus, y que a menudo están infradiagnosticadas (4). La incidencia de bacteriemia por Campylobacter en relación a la incidencia de enteritis es del 0,1% al 1% (24). La mayoría de los casos se dan en pacientes de edad avanzada o inmunodeprimidos con una o más patologías subyacentes, incluyendo cirrosis hepática y otras enfermedades hepáticas, neoplasias o infección por VIH.

      Otras manifestaciones extraintestinales incluyen meningitis y complicaciones cardiovasculares como son la endocarditis, miocarditis, pericarditis y miopericarditis, así como complicaciones reproductivas con distintas especies de Campylobacter. Otros síndromes relacionados principalmente con C. jejuni son el síndrome de Guillain – Barré (SGB), el síndrome de Miller-Fisher y la artritis reactiva Tipificación molecular Los principales usos de la epidemiología molecular son la detección de brotes así como la confirmación de las posibles fuentes de los casos de campilobacteriosis humana.

      La electroforesis de campo pulsante (ECP) se ha convertido en una importante herramienta de tipificación de los sistemas de vigilancia a nivel mundial. En este método todo el genoma de un organismo es cortado por enzimas de restricción de baja frecuencia, y los fragmentos generados se separan según tamaño. Esta técnica se ha convertido en un método muy importante para tipificar patógenos alimentarios, en especial C. jejuni y C. coli.

      El método de ECP es válido para establecer relaciones clonales entre cepas a corto plazo y existen varios protocolos estandarizados, siendo utilizados por PulseNet. La gran variabilidad en los perfiles de ECP de C. jejuni y C. coli hace que no se pueda utilizar en estudios a largo plazo.

      Para estudios epidemiológicos a largo plazo se ha usado con éxito el MLST o tipificación multilocus de secuencias, basado en la amplificación y secuenciación de varios genes (genes conservados) distribuidos a lo largo del genoma. A cada secuencia única se le asigna un número de alelo y la combinación de todos esos alelos se le denomina secuenciotipo (ST). Las cepas que tienen cuatro o más alelos iguales en comparación al genotipo central se asignan al mismo complejo clonal o linaje. Sin embargo, existen varios inconvenientes. Uno de ellos es que, dada la gran variabilidad genética de este microorganismo, los genotipos más infrecuentes no amplifican con los cebadores habituales; otro inconveniente es que, a menudo, esta técnica no es suficientemente discriminatoria en los estudios a corto plazo, como las investigaciones de brotes.

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      Por otro lado, para bacterias con genoma pequeño como Campylobacter, la WGS (secuenciación masiva) es comparable en precio a un MLST tradicional. Del WGS podemos obtener mucha más información, también para la tipificación.

      La selección del método más apropiado dependerá de una serie de factores, incluyendo el número de cepas a analizar, el propósito del estudio (epidemiología de un intervalo corto o de un intervalo largo), la necesidad de comparar los resultados con bases de datos públicas y, por supuesto, la disponibilidad de los recursos para realizarlas.

      Mecanismos de resistencia antibiótica de Campylobacter Quinolonas El amplio espectro de acción de estos antibióticos frente a microorganismos gram-negativos y gram-positivos ha determinado su uso masivo en todo el mundo.

      Las topoisomerasas de clase II (ADN girasa y topoisomerasa IV) son los enzimas diana de las quinolonas. Estos antibióticos se unen al enzima cuando éste se ha unido al ADN y, por dos vías diferentes, provocan la fragmentación del ADN cromosómico y finalmente la muerte celular.

      La resistencia se produce principalmente por sustituciones de aminoácidos en la región QRDR (Región Determinante de Resistencia a Quinolonas), la cual se localiza en el dominio de unión al ADN de estos enzimas. En Campylobacter solo encontramos la ADN girasa, y las mutaciones se encuentran en la subunidad GyrA.

      La mutación más frecuentemente encontrada es la C257T del gen gyrA, que lleva a la sustitución aminoacídica Thr86Ile, y que confiere alto nivel de resistencia.

      Por tanto, en C. jejuni y C. coli, la ausencia de una diana secundaria (topoisomerasa IV) para las fluorquinolonas determina que una única modificación de la subunidad GyrA de la ADN girasa sea suficiente para producir un fenotipo de resistencia a estos antimicrobianos.

      Por otro lado, la bomba de eflujo multifármaco CmeABC se ha descrito como un mecanismo adicional causante de resistencia a antimicrobianos, incluidos las fluorquinolonas y los macrólidos. Es el principal sistema de eflujo existente en Campylobacter y se ha asociado a resistencia a fluorquinolonas en asociación con las mutaciones en el gen gyrA, sin embargo, la sobreexpresión de esta bomba sólo confiere un incremento modesto de las CMI de los antibióticos en relación a la expresión basal de dicha bomba.

      Macrólidos Los macrólidos inhiben la síntesis proteica uniéndose a la unidad 50S del ribosoma de la bacteria.

      Campylobacter posee tres copias en su cromosoma del gen ARNr23S. Las sustituciones en las posiciones 2074 y 2075 del residuo de adenina son las principales mutaciones que confieren resistencia a eritromicina. Las mutaciones A2074C, A2074G y A2075G confieren alto nivel de resistencia a macrólidos (CMI de eritromicina > 128 μg/ml) en C. jejuni y C. coli. La resistencia a eritromicina suele dar resistencia cruzada con otros macrólidos como azitromicina y claritromicina así como con otros antibióticos relacionados como las lincosamidas (clindamicina) y los grupos de estreptograminas. Generalmente las tres copias del gen están mutadas, aunque algunas cepas con CMI más bajas pueden presentar dos copias mutadas, sugiriendo un efecto de dosis.

      Recientemente se ha descrito la presencia del gen ermB como causa de resistencia de alto nivel a macrólidos. La primera cepa en la que se encontró fue un C. coli de un cerdo en China en 2014. El enzima dimetila una única adenina en ARNr23S, provocando una menor unión de los macrólidos.

      Con respecto a la bomba de expulsión CmeABC, actúa de forma sinérgica junto a las mutaciones en el gen diana.

      JUSTIFICACIÓN La campilobacteriosis es una causa fundamental de gastroenteritis con una alta incidencia en todo el mundo. Aunque en la mayoría de los casos el tratamiento antibiótico no es necesario, en las edades extremas de la vida, pacientes inmunodeprimidos o con un proceso grave o de larga duración, este tratamiento está indicado, así como en las bacteriemias por C.coli.

      La resistencia bacteriana a los antimicrobianos es un tema actual de gran preocupación por el abuso y utilización inapropiados de los mismos tanto en salud humana como veterinaria. Los datos de resistencias en C. coli son dispares según la localización geográfica que se esté considerando y el aumento de las mismas suponen un problema de salud pública dada la elevada prevalencia de gastroenteritis por este microorganismo y las posibles complicaciones que de él pueden derivarse.

      Aunque según la bibliografía disponible la mayoría de los casos se produzcan de forma esporádica, es interesante investigar más profundamente las infecciones de nuestro medio con objeto de averiguar si existen conexiones o no entre casos y a lo largo del tiempo que nos pudiera orientar a orígenes comunes de las infecciones por este microorganismo en nuestro medio.

      Por todo ello, en el presente trabajo planteamos la consecución de los siguientes objetivos:

      OBJETIVOS 1. Determinar la distribución demográfica de las infecciones por C. coli en nuestro medio, con respecto a la edad y el sexo, así como establecer las características y sintomatología de los pacientes afectados por el mismo que requieren de ingreso hospitalario.

      2. Determinar la sensibilidad de las cepas aisladas de C. coli a los antibióticos de elección para su tratamiento.

      3. Comparar las técnicas de microdilución en caldo (MDC) y difusión en agar con tiras de gradiente antibiótico (GA) y determinar la distribución de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de los distintos antimicrobianos estudiados por ambos métodos.

      4. Conocer la frecuencia de los diferentes patrones de resistencia y su evolución temporal durante el periodo de estudio.

      5. Estudiar los mecanismos moleculares que subyacen en la resistencia a ciprofloxacino y eritromicina.

      6. Evaluar dos técnicas moleculares de tipificación molecular como son la electroforesis en gel de campo pulsante (ECP, o en inglés, PFGE), y el análisis de los fragmentos de restricción tras digestión del gen flaA (PCR-RFLP), para establecer la relación clonal en las cepas estudiadas y su posible aplicación al estudio de la epidemiología de estas infecciones.

      7. Establecer la posible relación clonal entre las cepas con similares patrones de resistencia.

      RESULTADOS Aspectos demográficos y clínicos Observamos un predominio del sexo masculino (63% de los casos) así como dos grupos de edad con un mayor número de casos de infección por C. coli: niños de entre 1 y 5 años (43,5%) y adultos con más de 40 años (17,4%). La media de edad fue de 6 años.

      Quince (16,3%) pacientes estuvieron hospitalizados, y el 53,3% de estos se incluía en el grupo de más edad. Además, la mayoría de estos pacientes padecía alguna enfermedad de base importante como neoplasia, trasplante, enfermedad autoinmune o enfermedad renal crónica.

      Sensibilidad antibiótica Se determinó la sensibilidad a ciprofloxacino, eritromicina, tetraciclina y clindamicina mediante los métodos microdilución en caldo y difusión con tiras de gradiente antibiótico. Además, la sensibilidad a azitromicina y gentamicina se realizó sólo por microdilución en caldo y para tobramicina, amoxicilina–ácido clavulánico e imipenem con la difusión mediante tiras de gradiente antibiótico.

      Ciprofloxacino La microdilución en caldo tiende a obtener unas CMI mucho más bajas, siendo 8 μg/ml la mediana obtenida por este método y 64 μg/ml la obtenida mediante tiras de gradiente antibiótico. Ambas técnicas clasificaron a las cepas en las mismas categorías clínicas, con 90 cepas (94,7%) resistentes a ciprofloxacino. Por tanto, la concordancia entre ambos métodos fue del 100% y el índice kappa (Ƙ=1) indicó la completa concordancia en los resultados de ambas pruebas. Sin embargo, el parámetro de la U de Mann–Whitney mostró diferencias significativas entre ambos métodos (p < 0,001), lo cual podemos explicar por las diferencias en los valores de CMI obtenidos, ya que este parámetro determina si existen diferencias significativas entre las medianas de los métodos.

      Eritromicina Aunque los valores de CMI obtenidos para este antimicrobiano por ambos métodos no son muy diferentes, sí hubo diferencias estadísticamente significativas (p = 0,023) en la mediana, que por microdilución en caldo fue de 0,5 μg/ml y por tiras de gradiente antibiótico, de 1,5 μg/ml. Setenta y dos (75,8%) cepas son sensibles mediante la tira de gradiente antibiótico, mientras que por microdilución en caldo son sensibles 73 cepas (76,8%). Esto es debido a que la cepa 59 es heterorresistente, ya que podemos encontrar colonias dentro de la elipse de inhibición, hecho que no fue detectado mediante la microdilución en caldo El porcentaje de acuerdo entre las técnicas fue del 98,9%, y el índice kappa (Ƙ=0,97) indicó una correlación casi completa.

      Tetraciclina La microdilución en caldo identificó más cepas resistentes (77 aislamientos) que las tiras de gradiente antibiótico (74 aislamientos). La concordancia entre ambos métodos fue del 96,8% y el índice kappa (Ƙ= 0,89) indicó una correlación casi completa; sin embargo, el valor de este índice fue el más bajo entre todos los antimicrobianos que hemos comparado. Las medianas por microdilución en caldo y por tiras de gradiente antibiótico son 64 μg/ml y 128 μg/ml respectivamente, y no había diferencias significativas entre ambos métodos (p= 0,108).

      Clindamicina El método de tiras de gradiente antibiótico identificó dos cepas resistentes más que el método de microdilución en caldo, 21 aislamientos frente a 19. La concordancia entre ambas técnicas fue del 97,9% y la índice kappa (Ƙ= 0,93) estableció una correlación casi completa entre ellas. Las medianas obtenidas fueron de 0,25 μg/ml para microdilución en caldo y de 0,5 μg/ml para tiras de gradiente antibiótico. La U de Mann–Whitney mostró diferencias significativas entre ambos métodos (p= 0,022).

      La comparación de ambos métodos se ha hecho mediante la concordancia categórica y esencial; un método comúnmente usado para comparar diferentes métodos de sensibilidad antibiótica.

      En el caso de ciprofloxacino, no hay errores graves ni leves. En el caso de eritromicina, hay un error grave, por lo que sólo tenemos un 1,05% de errores graves en eritromicina. En tetraciclina es donde encontramos mayores discrepancias; existiendo 3 cepas resistentes por microdilución y sensibles por tira de gradiente antibiótico. De esta forma, obtenemos un 3,16% de errores muy graves, no cumpliendo con las exigencias de la FDA. Con respecto a clindamicina, encontramos un 2,11% de errores graves.

      En cuanto a la concordancia esencial, vemos que teniendo en cuenta las CMI obtenidas, los grados de concordancia son menores. De hecho, para ciprofloxacino es tan sólo del 32,63%; cuyo valor p de significación estadística que obteníamos mediante la U de Mann Whitney (p < 0,001), refleja las diferencias entre las medianas por ambas técnicas. El resto de los porcentajes de concordancia de CMI obtenidas no son tan bajos como con ciprofloxacino. Nos llama la atención que, para clindamicina, el porcentaje de concordancia sea del 86,32% y, sin embargo, la estadística encontrara diferencias significativas.

      En cuanto a los demás antibióticos probados hemos encontrado que con respecto a los aminoglucósidos las cepas son mucho más sensibles a gentamicina (96,8%, microdilución en caldo) que a tobramicina (57,9%, tiras de gradiente antibiótico). Solo el 57,9% de las cepas fueron sensibles a amoxicilina–ácido clavulánico y todas ellas lo fueron a imipenem.

      Además, hemos comprobado que las cepas resistentes a eritromicina presentan también niveles de resistencia mayores a varios antimicrobianos. Estas diferencias son estadísticamente significativas en los casos de tetraciclina, tobramicina, gentamicina y clindamicina.

      En cuanto a la evolución temporal de las resistencias a lo largo del periodo estudiado, las tendencias son diferentes según el antimicrobiano de que se trate. Tanto ciprofloxacino como eritromicina y clindamicina muestran una tendencia ascendente a partir del año 2012. En cambio, tobramicina y amoxicilina – ácido clavulánico muestran una tendencia al descenso, aunque no muy acusada en este último. Con respecto a tetraciclina se observan picos sucesivos de aumento y descenso, siempre dentro de un porcentaje alto de resistencias.

      Mecanismos moleculares de resistencia a ciprofloxacino.

      Ochenta y cuatro de las cepas (93,3%) resistentes a ciprofloxacino presentan la modificación Thr86Ile en GyrA, detectada mediante MAMA-PCR.

      Sin embargo, 6 cepas, correspondiente al 7%, no presentaban la mutación según los resultados de esta técnica, ni tampoco el alelo correspondiente a la forma salvaje (WT, wild type) del gen. Secuenciamos la región QRDR con la intención de detectar otras posibles mutaciones que justificaran la resistencia a ciprofloxacino en estas 6 cepas y dos que habían presentado una amplificación débil del gen mutante. Todas las cepas presentaron la sustitución Thr86Ile que confiere resistencia a quinolonas, por lo que detectamos 6 falsos negativos en esta técnica.

      Además, en tres cepas (25, 52 y 108) se asoció también con la sustitución Asp90Asn que confiere resistencia moderada, pero todas estas cepas al presentar la mutación doble, desarrollaron un alto nivel de resistencia: CMI de 32 μg/ml .

      Mecanismos moleculares de resistencia a eritromicina.

      La técnica de MAMA-PCR permite detectar la presencia de la mutación A2075G en el gen del ARNr23S, que es responsable de resistencia a eritromicina. Esta mutación estaba presente en 21 (91,3%) de las 23 cepas resistentes. En las cepas 59 y 75 la amplificación del gen salvaje demostró que las tres copias del gen no están mutadas. Las CMI de las cepas 59 y 75 son 12 μg/ml y ≥256 μg/ml respectivamente mediante el método de difusión con tiras de gradiente antibiótico.

      Se confirmaron mediante el método de PCR–RFLP todos los casos de mutación A2075G, y en las dos cepas que no tenían todas las copias del gen mutadas encontramos también la secuencia correspondiente al gen salvaje. No encontramos la mutación en la posición 2074 en nuestras cepas.

      En dos cepas resistentes a eritromicina no hemos encontrado ninguna de las mutaciones que estudiamos y, aunque se realizó una PCR para detectar el gen ermB en todas las cepas con fenotipo de resistencia, no lo hemos hallado en ninguno de nuestros aislamientos.

      Epidemiología molecular La técnica de ECP se realizó en 95 cepas, de las cuales fueron tipificables 94 (98,9%). Las cepas presentaron una elevada diversidad genética, detectándose 33 pulsotipos distribuidos en 21 pulsotipos únicos y 12 con un número cepas entre 2 y 12, al aplicar un punto de corte de similitud igual o superior al 80%. Los grupos A–D presentaron diez o más cepas cada uno.

      La técnica de PCR-RFLP del gen flaA también permitió tipar 94 de las 95 cepas. Esta técnica clasificó a las cepas en 50 tipos, de los cuales 30 pertenecían a cepas individuales y los otros 20 tipos agrupaban a 64 cepas en grupos de entre 2 y 8 aislamientos con un punto de corte de similitud del 100%. Los tipos Dde2 y Dde27 aparecieron en 6 y 8 cepas respectivamente.

      A la hora de detectar posibles brotes, no hacemos referencia a criterio espacial alguno ya que todas las cepas pertenecen a pacientes del distrito sanitario Sevilla, hemos aplicado dos criterios temporales, 11 días y 2 meses entre las fechas de aislamiento de las cepas.

      Mediante ECP vemos que aparecen 6 posibles brotes con dos cepas en cada uno de ellos. Por tanto, del total de las 73 cepas relacionadas genéticamente, tras la aplicación de los criterios de selección solamente quedaron 12, lo cual supone una reducción del 83,6%. Siete posibles brotes, con dos cepas cada uno, se detectaron con PCR–RFLP del gen flaA. Por tanto, sólo 14 de las 64 cepas relacionadas genéticamente, cumplían los criterios de selección, lo que supone una reducción del 78,1%. Es de destacar que ambas técnicas han identificado 5 brotes con las mismas cepas incluidas.

      El segundo criterio temporal de dos meses podría ser el más adecuado para detectar posibles fuentes de contaminación de alimentos asociadas a una manipulación deficitaria de los mismos, en lugar de relacionar casos que se han infectado en el mismo día y lugar y a través del mismo medio.

      Así, mediante ECP y utilizando este criterio obtendríamos 20 posibles brotes que incluyen a 49 cepas, y la reducción de las cepas genéticamente relacionadas sería de un 32,9%. Sin embargo, mediante PCR-RFLP del gen flaA encontramos 12 posibles brotes que involucran a 30 cepas. De esta forma la reducción de cepas al seleccionar los posibles brotes sería de un 53,1%.

      Los posibles brotes comunes con el criterio temporal de 11 días también lo son con el de dos meses; aunque dos de los posibles brotes se agrupan para formar uno solo (cepas 105, 109, 111, 114, 115 y 116) y además aparece otro posible brote común formado por las cepas 68 y 70. Finalmente, la cepa 12 forma parte de un brote junto a la cepa 20 mediante tipificación del gen flaA; pero la cepa 12 no fue tipificable por ECP.

      La relación entre las cepas a través de la tipificación molecular debería completarse con los datos epidemiológicos clásicos, ya que sin una conexión entre los casos que determine un origen común (un restaurante, un trabajo, un supermercado, etc…), es difícil establecer de forma inequívoca un brote. En nuestro caso no fue posible realizar entrevistas a los pacientes con el objeto de recoger datos específicos, y en las historias clínicas estos estaban ausentes.

      Hemos calculado el Índice de Simpson (SID) para ambas técnicas. Este índice permite cuantificar el poder discriminativo de una técnica y se define como la probabilidad promedio de que el marcador utilizado clasifique en 2 tipos distintos a 2 cepas no relacionadas escogidas al azar de la población de un determinado taxón. La diferencia en los valores para ambas técnicas (p < 0.001) se debe al diferente punto de corte de similitud que hemos utilizado para considerar a dos cepas como del mismo tipo; siendo del 80% para ECP y del 100% para PCR-RFLP del gen flaA. Por este motivo podría parecer que la técnica de tipificación del gen flaA tiene mayor poder de discriminación.

      De hecho, si los grupos incluyeran únicamente cepas idénticas (100% de similitud), mediante la técnica de ECP, aparecerían 73 tipos distintos de 94 cepas totales y 12 grupos de entre 2 y 5 cepas que aúnan 33 casos. Si calculamos el índice de Simpson en estas condiciones, el valor que obtenemos es de 0,992 (CI 95%= 0,987 - 0,997). Por tanto, en igualdad de condiciones, ECP tiene mayor poder de discriminación que la PCR-RFLP del gen flaA con una diferencia estadísticamente significativa (p= 0,007).

      Los índices obtenidos nos indican que esta bacteria se caracteriza por una gran heterogeneidad genética y el alto poder de discriminación de ambas técnicas. En la práctica el índice de Simpson debe tener un valor de entre 0.90 y 0.95 para que un método se considere robusto.

      La concordancia entre ambos métodos se determinó calculando los coeficientes de Rand y Wallace. La concordancia entre los dos métodos aplicados fue baja, con un coeficiente ajustado de Rand de 0,164 (95% CI = 0,048 – 0,284), un coeficiente de Wallace para la combinación ECP/PCR-RFLP flaA de 0,111 (95% CI= 0,038 – 0,184) y el mismo para la combinación PCR-RFLP flaA/ECP de 0,318 (95% CI= 0,128 – 0,519). A pesar de que estos valores nos indican una baja congruencia entre los métodos aplicados, y que por tanto no son redundantes, existen coincidencias en los posibles brotes encontrados, sobre todo cuando aplicamos el criterio temporal más restrictivo de 11 días, donde existen 5 brotes coincidentes. Sin embargo, cuando aplicamos el criterio de 2 meses aparecen 20 posibles brotes por ECP y solo 12 mediante PCR-RFLP flaA. Por ambos métodos aparecen brotes que no son coincidentes y tal vez esto es un reflejo de la falta de concordancia entre los métodos.

      Finalmente hemos evaluado la posible existencia de una relación clonal entre las cepas pansensibles así como de las cepas panresistentes y no existe relación alguna.

      CONCLUSIONES 1. Los niños de entre 1 y 5 años, así como las personas de más de 40 años son los principales grupos de edad afectados por la infección por C. coli. Un porcentaje importante requiere ingreso hospitalario, principalmente en personas mayores y con enfermedades de base. La diarrea, dolor abdominal y fiebre son los síntomas más frecuentes, seguidos de náuseas y vómitos. El género masculino es ligeramente predominante. No hay una estacionalidad marcada en la infección por C. coli, aunque sí un mayor número de casos en primavera.

      2. Los antibióticos que mostraron mayor actividad frente a C. coli fueron imipenem y gentamicina, mientras que la resistencia a ciprofloxacino es prácticamente universal. Encontramos tasas de resistencia bastante altas en el resto de los antibióticos probados. Es destacable que el 24% de las cepas fueron resistentes a eritromicina, tratamiento de elección en estas infecciones.

      3. Las cepas resistentes a eritromicina presentan niveles mayores de resistencia a los demás antimicrobianos, siendo estadísticamente significativo en el caso de tetraciclina, tobramicina, gentamicina y clindamicina.

      4. El método de microdilución en caldo tiende a dar CMI más bajas que el de tiras de gradiente antibiótico con todos los antibióticos probados excepto con tetraciclina. Existe una alta concordancia categórica para los antibióticos probados por ambos métodos, sin embargo, la concordancia esencial es bastante menor, siendo estadísticamente significativa en el caso de ciprofloxacino, debido a los altos valores de CMI de nuestras cepas.

      5. Nuestros resultados, en concordancia con la literatura, confirman que la mutación de resistencia a quinolonas más frecuente es la C257T (ACT ATT), que conlleva el cambio aminoacídico Thr86Ile. Aunque esta sustitución se ha relacionado con altos niveles de resistencia a ciprofloxacino, en nuestro trabajo encontramos cepas con CMI por microdilución en caldo que corresponden a resistencia considerada de bajo nivel y todas ellas presentan la mutación mencionada. Además, existen mutaciones silenciosas que originan polimorfismos en la región QRDR del gen gyrA.

      6. La mutación puntual A2075G en el gen que codifica el ARNr23S es la más frecuente y otorga alto nivel de resistencia a macrólidos. No hemos detectado la presencia del gen ermB en la población de C. coli de nuestra zona y, por tanto, no contribuye a la resistencia a macrólidos. La secuenciación del gen del ARNr23S en las cepas resistentes sin las mutaciones estudiadas podrían identificar mutaciones en otras posiciones no detectadas hasta la fecha.

      7. Las dos técnicas utilizadas para la tipificación clonal, ECP y PCR-RFLP del gen flaA, presentan un buen poder de discriminación y son robustas, aunque la técnica de ECP es mucho más laboriosa.

      8. Las técnicas son poco coincidentes en la agrupación de cepas, sin embargo, en un mismo contexto espacio-temporal, la mayoría de los brotes son detectados por ambas técnicas y las cepas incluidas son las mismas. La validez y utilidad de estas técnicas han de establecerse en conjunción con los datos obtenidos de la epidemiología convencional.

      9. Las cepas clínicas de C. coli presentan una elevada heterogeneidad genética. No obstante, las técnicas de tipificación molecular agrupan a un número relativamente amplio de cepas que se ve reducido tras la aplicación de los criterios temporales para identificar posibles brotes de campilobacteriosis. La magnitud de esta reducción depende de la exigencia de los criterios aplicados y, la selección de estos, del objetivo que se persiga.


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