Proteínas relevantes en la homeostasis de metales pesados en el hongo oportunista Fusarium oxysporum
- Autores: Dámaris Lorenzo Gutiérrez
- Directores de la Tesis: Loida López Fernández (dir. tes.), Javier Capilla Luque (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Rovira i Virgili ( España ) en 2020
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Jorge González Zuelgaray (presid.), Dania García Sánchez (secret.), Mercè Capdevila Vidal (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad Rovira i Virgili
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
Las metalotioneínas (MTs) son proteínas intracelulares de bajo peso molecular ricas en cisteínas que mediante la unión a metales pesados participan en su homeostasis actuando de reservorios y contribuyendo a aumentar la tolerancia celular a Cd, Cu, Fe, Ag y Zn, entre otros. El papel de las MTs en virulencia se ha demostrado en bacterias y hongos tales como Cryptococcus, ya que secuestran el Cu presente en los fagolisosomas de macrófagos tras la fagocitosis del microorganismo. En Candida albicans y Aspergillus fumigatus se ha demostrado que además participan proteínas exportadoras de metales (CrpA) y especies reactivas de oxígeno, respectivamente.
El objetivo del presente trabajo fue caracterizar dos proteínas relevantes involucradas en la homeostasis de metales pesados en Fusarium oxysporum: la metalotioneína Mt1 (FOXG_02862) y la proteína exportadora de cobre CrpF (FOXG_03265) y evaluar su rol en la virulencia. Y los objetivos específicos derivados de este objetivo general fueron:
- Detección in silico de los genes mt1 (FOXG_02862) y crpF (FOXG_03265) en el genoma de F. oxysporum.
- Generación de cepas de F. oxysporum mutantes defectivas (KO) en mt1 (Δmt1) y crpF (ΔcrpF).
- Caracterización fenotípica de los mutantes Δmt1 y ΔcrpF frente a diferentes metales pesados y evaluación de la acumulación de cobre en el mutante ΔcrpF.
- Evaluar la expresión de genes relacionados con la homeostasis de metales pesados y con estrés oxidativo en las cepas mutantes (Δmt1 y ΔcrpF) y en la silvestre (wt), en ausencia o presencia de metales pesados (Cadmio, Cobre y Zinc).
- Evaluar la virulencia de las cepas Δmt1 y ΔcrpF en líneas celulares de macrófagos, en modelos murinos de infección sistémica y en tomatera.
- Estudiar las preferencias de unión a los metales pesados Cadmio, Cobre y Zinc de la hipotética Mt1 localizada en F. oxysporum mediante Espectrometría de Masas de Ionización por Electroespray (ESI-MS).
- Localizar subcelularmente a la proteína Mt1 en la cepa 4287 de Fusarium oxysporum mediante técnicas de inmunodetección.
La metodología utilizada para cumplir los objetivos establecidos fue:
• Análisis in silico empleando diferentes bases de datos donde se encuentran disponibles los genomas completos de los hongos bajo estudio (JGI Genome Portal, NCBI, FungiDB) y mediante el uso de programas bioinformáticos que permiten el manejo y la comparación de secuencias (DNASTAR Lasergene, SnapGene, Mega7, Oligo7).
• Extracción de ADN genómico y plasmídico.
• Amplificación por PCR de los genes de interés y síntesis de vectores de deleción.
• Transformación de protoplastos de las estirpes silvestres y mutantes con la correspondiente construcción para delecionar el gen diana y posteriormente con el gen completo con su promotor y terminador para complementar la estirpe defectiva. Los transformantes resultantes se seleccionarán mediante crecimiento en medio selectivo conteniendo el antibiótico de selección.
• Comprobación de la correcta generación del mutante knock-out (y del complementado) mediante análisis Southern blot.
• Cultivo de los hongos en diferentes medios nutritivos y mínimos (medios sintéticos, PDB, PDA) suplementados con antibióticos de selección (higromicina, noursotricina) y suplementados con metales (CuSO4, CdCl2, ZnCl2, AgNO3).
• Purificación y expresión de la proteína Mt1 en la bacteria BL21 a gran escala. Expresión de la proteína en condiciones control e inducción de metales pesados.
• Caracterización espectroscópica de los complejos metal-MT en Fusarium oxysporum. ESI-MS.
• Generación de anticuerpos policlonales anti-Mt1.
• Extracción de proteínas totales del hongo, fraccionamiento subcelular. Western blot para detectar y localizar la proteína Mt1 en las diferentes fracciones subcelulares de F. oxysporum.
Las conclusiones de la presente tesis son:
1. Hemos detectado una única metalotioneína (Mt1, FOXG_02862) en el genoma de F. oxysporum que muestra una secuencia aminoacídica rica en cisteínas y más larga que las asociadas a las MTs presentes en hongos, las cuales suelen ser más cortas. Además, la identificación de las secuencias consenso conocidas como elementos reguladores de metales (metal regulatory elements, MRE) localizados agua arriba de mt1 refuerza la hipótesis de la participación de esta proteína en la homeostasis de metales pesados.
2. Por primera vez el presente estudio proporcionó evidencia de que la proteína Mt1 de F. oxysporum aumenta la tolerancia al Cd, Cu y Zn. El hecho de que mt1 no esté regulada transcripcionalmente por Cd o Cu, pero sí por Zn revela una regulación específica. Por lo tanto, Mt1 juega un rol importante en la homeostasis del Zn.
3. La respuesta del mutante Δmt1 al estrés generado por la presencia de metales pesados no condujo a una mejor transcripción de los genes gapdh ni prx. Esto parece indicar que Δmt1 aparentemente no sufre estrés oxidativo en presencia de metales, posiblemente debido a la activación de otros mecanismos que contribuirían a la tolerancia del metal.
4. Mt1 contribuye a la resistencia de la muerte celular mediada por macrófagos, ya que su carencia reduce la supervivencia fúngica dentro del fagosoma. Sin embargo, mt1 no participa en la patogenicidad en un sistema modelo vegetal sobre plantas de tomate Lycopersicum esculentum y tampoco en otro animal en ratones, como si se había reportado en otros hongos.
5. Se han identificado in silico en el genoma de F. oxysporum 6 genes que codifican para hipotéticos transportadores de Cu ortólogos a otros ya descritos en S. cerevisiae y A. fumigatus. Se ha estudiado la proteína CrpF (FOXG_03265) la cual es la homóloga putativa de la ATPasa transportadora de Cu, CrpA de A. fumigatus involucrada en virulencia. La presencia de ciertos dominios proteicos ha permitido corroborar que CrpF es una hipotética ATPasa exportadora de Cu tipo PIB y estos dominios son: i) ocho hélices transmembrana (TMH) que contienen el motivo CPC dentro del motivo TMH6 ii) dominios de unión a metales (MBD) conformados por las secuencias consenso CxxC y iii) otros dominios asociados a metales pesados (HMA) que contienen las secuencias consenso GMxCxxC.
6. Se ha demostrado por primera vez que el exportador de Cu de F. oxysporum CrpF contribuye significativamente a aumentar la tolerancia al Cu, Cd y Zn. Sin embargo, la disponibilidad del Cu regula la expresión de crpF a través de la activación de la transcripción específica por dicho ion. Además, el mutante ΔcrpF parece verse afectado en la exportación de Cu, ya que sufre acumulación de Cu intracelular más allá de los niveles homeostáticos. Por lo tanto, CrpF juega un papel importante en la homeostasis de Cu, que podría resumirse en su papel en el transporte de cobre a través de membranas y en la desintoxicación del exceso de cobre.
7. El análisis transcripcional de genes de respuesta a metales o relacionados con estrés oxidativo demostró que la falta de crpF conduce a una fuerte activación de la metalotioneína mt1 y de la peroxiredoxina prx en presencia de Zn. A pesar de que la ausencia de crpF casi no tiene impacto en la tolerancia al Zn, todo parece indicar que este gen estaría participando indirectamente en la homeostasis de dicho metal en F. oxysporum. El mayor nivel de aceA en el mutante ΔcrpF con respecto al wt podría entenderse como un mecanismo de defensa fúngica bajo deficiencia de crpF y demostraría el papel de este factor de transcripción en la regulación de la expresión de CrpF, confirmado ya en otros hongos filamentosos.
8. CrpF es esencial para la patogénesis fúngica en plantas. Sin embargo, la pérdida de la función de crpF no afecta a la capacidad de infección en ratones o en infecciones en macrófagos.
9. La elevada inducción de mt1 en presencia de Zn, demostrada en los estudios de expresión génica, se ha corroborado en los resultados preliminares de espectrometría de masas por electrospray (ESI-MS) y de Espectrometría de emisión atómica de plasma acoplado por inducción (ICP-AES). Los resultados preliminares mostraron una predilección de Mt1 por el Zn y todo parece indicar que esta proteína es una Zn-tioneína. Los resultados definitivos de estos experimentos ayudarán a conocer cuan genuina es esta mayor afinidad por el Zn y cuál es el grado de promiscuidad de esta proteína si es que existe.
