Resumen de Validating pepck-m inhibitor compounds in cancer therapeutics ans its impact in calcium cell signaling
Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) es un encima que cataliza la descarboxilación del oxalacetato a fosfoenolpiruvato a expensas de una molécula de GTP, permitiéndo la comunicación de intermediarios del TCA com la glucólisis más allá de fosfoenolpiruvato. Este encima presenta dos isoformas con propiedades cinéticas idénticas, una cltosólica y otra mitocondrial {PEPCK-C y PEPCK-M respectivamente). Por su parte, PEPCK-M está muy expresada en células tumorales, jugando un papel clave en la respuesta al estrés nutriclonal y reticular, controlando el flujo de carbonos desde metabolitos alternativos a glucosa, como glutamina, hacia aminoácidos que actúan de precursores de biosíntesis para sustentar la proliferación celular. Este hecho hace de la PEPCK-M una diana clave en el desarrollo de futuras terápias contra la progresión tumoral. Es este sentido, en esta tesis se modificó, sintetizó, y validó en líneas celular de cancer de colon y mama, en colaboración con el Dr. Javier Luque y la Dra. Carmen Escolano, potentes inhibidores descritos contra PEPCK-C, basados en modificaciones del compuesto 3-alkyl-1,8-dibenzylxanthine para la PEPCK-M (PEPCKi-1 y PEPCKi-2). La validación de estos compuestos fue realizada in vitro a partir de extractos procedentes de hígado de ratón y células MEF y su potencia fue comparada con la del clásico inhibidor de PEPCK 3-mercaptopicolinic acid (3-MPA), además de con estudios funcionales sobre el crecimiento y viabilidad tumoral en 2-D y 3-D. Por otro lado, la capacidad de entrar en la mitocondria del PEPCKi-2 fue testada in vitro a través de la capacidad de inhibir la secreción de insulina estimulada por glucosa de células INSl e In vivo mediante la medición de la insulinemia tras realizar un test de tolerancia a la glucosa. Finalmente se descartaron efectos off-target del inhibidor PEPCKi-2 debido a la ausencia de efecto sobre la viabilidad celular de células SW480 PCK2 KO tratadas con PEPCKi-2.
Por otro lado, estudiamos el papel del PEP en células cancerosas de colon como señalizador celular a través de la movilización de calcio como consequencia de inhibir la bomba de calcio entre el citosol y el lúmen del RE SERCA, de forma similar a cómo ocurre en linfocitos T. Para ello, se estudió la movilización de calcio citosólico en presencia y ausencia de glucosa y con condiciones crecientes de PEP, así como el PEP intracelular, y se correlacionó con la activación de vías de señalización de calcineurina/NFAT y la fosforilación del oncogén c-myc en Ser62 dependiente de la vía de la calmodulina, observándose una dependencia de la disponibilidad de PEP procedente de glucosa en la activación de calcio y dichas vías controladas por calcio. Además, se utilizaron los inhibidores de PEPCK descritos y validados anteriormente para estudiar la implicación de PEPCK-M en el control de calcio a través del mantenimiento de los niveles de PEP, observándose que PEPCK-M puede interferir la regulación de PEP/Calcio, así como en la activación de NFAT y la fosforilación de c-myc tanto en presencia como en ausencia de glucosa. Estos datos amplian nuestra comprensión sobre el papel que ejerce PEPCK-M en células cancerígenas, más allá de una función directa en el mantenimiento de precursores de biosíntesís para la proliferación celular, sugiriendo un papel indirecto a través de la regulación del metabolismo vía calcio.
