Construction and characterization of live attenuated vaccines in modern lineages of mycobacterium tuberculosis based on phop and fadd26 deletions
- Autores: Irene Pérez Sánchez
- Directores de la Tesis: Jesús Gonzalo Asensio (dir. tes.), Carlos Martín Montañés (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2019
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Christophe Guilhot (presid.), Ainhoa Lucía Quintana (secret.), Esther Pérez Herran (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular por la Universidad de Zaragoza
- Materias:
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- Resumen
Tuberculosis es la enfermedad más devastadora producida por un único agente infeccioso. Mycobacterium tuberculosis, el principal agente causal de la tuberculosis en humanos, se transmite entre humanos por el aire. Se estima que en 2017, 1.3 millones de personas (HIV-negativas) murieron a causa de la tuberculosis además de 300, 000 muertes en personas con HIV y se estima que hubo 10 millones de nuevos casos de tuberculosis.
A pesar de la existencia de una vacuna preventiva, BCG, con una amplia cobertura de casi el 90% y la disponibilidad de antibióticos para el tratamiento de la tuberculosis, el aumento de cepas resistentes a los antibióticos y la variable eficacia de protección de BCG frente a la tuberculosis pulmonar hace que esta enfermedad sea la primera causa de muerte debido a un agente infeccioso en la actualidad.
Para superar este problema, varios nuevos candidatos a vacuna están siendo desarrollados para obtener una vacuna más eficaz. Una de ellas es MTBVAC, una vacuna viva atenuada basada en deleciones en los genes phoP y fadD26 en un aislado clínico perteneciente al linaje 4 de M. tuberculosis. Ambos genes son importantes factores de virulencia de M. tuberculosis.
Las micobacterias adaptadas a infectar a humanos presentan una distribución geográfica específica. Son clasificados en siete linajes que pueden diferenciarse entre “modernos” o “ancestrales” basándonos en la deleción TbD1. Los linajes 2, 3 y 4 de M. tuberculosis son los linajes modernos mientras que los linajes 1 y 7 de M. tuberculosis y los linajes 5 y 6 de Mycobacterium africanum son los linajes denominados ancestrales. Los linajes más ampliamente distribuidos son los linajes 2 y 4 de M. tuberculosis seguido de los linajes 1 y 3 de M. tuberculosis con una distribución intermedia y los otros linajes están presentes en determinadas zonas.
Teniendo en cuenta que MTBVAC se obtuvo en un aislado clínico del linaje 4 de M. tuberculosis, las mismas deleciones que en MTBVAC en los genes phoP y fadD26 fueron obtenidas en dos aislados clínicos de M. tuberculosis de los linajes 2 y 3, denominadas MTBVAC-L2 y MTBVAC-L3. Para obtener las deleciones se utilizaron dos estrategias diferentes de ingeniería genética. Por lo tanto, estas tres vacunas candidatas basadas en las deleciones de phoP y fadD26 obtenidas en los linajes modernos de M. tuberculosis, permiten la evaluación de la protección dependiente de linaje. Se realizaron análisis de Western-blot y qRT-PCR de los nuevos mutantes dobles para confirmar los fenotipos dependientes de PhoP y FadD26 que han sido descritos previamente en MTBVAC.
Se realizó la caracterización preclínica de experimentos de seguridad y eficacia de protección en el modelo de ratón. En experimentos de seguridad, tanto MTBVAC-L2 como MTBVAC-L3 mostraron atenuación, menor que MTBVAC, siendo solo MTBVAC más atenuada que BCG Pasteur en ratones SCID.
Para la evaluación de la eficacia en la protección, grupos de ratones fueron vacunados con MTBVAC, MTBVAC-L2, MTBVAC-L3, BCG Pasteur o no vacunados como control. Se evaluó la carga bacteriana en pulmones y bazo en estudios de protección frente a cepas virulentas de los linajes 2, 3 o 4 de M. tuberculosis. MTBVAC, MTBVAC-L2 and MTBVAC-L3 confirieron protección frente a las cepas modernas utilizadas para el desafío sin diferencias significativas entre ellas. Cabe destacar que las cepas MTBVAC y MTBVAC-L2 confirieron una mayor protección frente a la cepa del linaje 2-Beijijng en comparación con BCG Pasteur.
Estos resultados sugirieron protección independiente de linaje en ratones y refuerza el conocimiento previo sobre la eficacia de protección de MTBVAC en varios modelos animales.
Con objeto de profundizar con la caracterización de MTBVAC, tras estudio de genómica, transcriptómica y proteómica, nos enfocamos en el estudio de metabolitos producidos diferencialmente por MTBVAC. Se observó que la producción del metabolito di-AMP-cíclico (c-di-AMP) era dependiente de PhoPR. El mutante phoPR en H37Rv producía mayor cantidad de c-di-AMP que la cepa silvestre. La secreción del metabolito se observó solo en el mutante phoPR. También se observó una mayor producción y secreción de c-di-AMP en MTBVAC en comparación con la cepa silvestre.
El c-di-AMP es un segundo mensajero que está descrito su involucración en diferentes procesos en bacterias. En M. tuberculosis, el c-di-AMP bacteriano es capaz de desencadenar la respuesta de interferón de tipo I (IFN-β) mediante activación del sensor eucariótico STING. Para evaluar si el c-di-AMP de MTBVAC activa esta respuesta en el hospedador, se obtuvieron deleciones en MTBVAC en los genes que codifican para la ciclasa y la fosfodiesterasa del c-di-AMP. Por lo tanto, se obtuvieron tres cepas diferentes de MTBVAC con diferentes niveles de c-di-AMP. A pesar de los aumentados niveles de c-di-AMP bacteriano en MTBVAC, no se observó respuesta de IFN-β tras la infección en células THP-1. En cambio, MTBVAC y los mutantes en la ciclasa y fosfodiesterasa del c-di-AMP mostraron respuesta IL-1β.
