Resumen de Caracterización de un mutante dominante negativo de la proteína quinasa ck2 en arabidopsis y su utilización en el estudio de la implicación de ck2 en los mecanismos de respuesta a daño en el dna
Esta tesis se enmarca dentro de un proyecto de investigación más general cuyo objetivo es la caracterización y el estudio de la proteína quinasa CK2 en plantas. La proteína CK2 es una Ser/Thr fosfotransferasa, evolutivamente muy conservada, compuesta por dos subunidades, ¿ (catalítica) y ß (reguladora), que se combinan para formar un complejo tetramérico (¿2ß2). Los genomas vegetales contienen múltiples genes para cada subunidad, la expresión de los cuales puede dar lugar a diferentes holoenzimas activas. Para poder estudiar los efectos de la pérdida de función de CK2 durante el desarrollo de las plantas, se ha utilizado como aproximación experimental la construcción de un mutante dominante negativo. Un residuo de lisina, esencial para la catálisis, se sustituyó por metionina mediante mutagénesis dirigida, obteniéndose una subunidad catalítica inactiva. El gen mutado se clonó bajo el control de un promotor inducible por glucocorticoides. La construcción se introdujo en plantas de Arabidopsis, el estudio de las cuales ha sido el principal objeto de esta tesis.
La primera parte del trabajo de tesis se centra en la caracterización de dichas plantas transgénicas y en el establecimiento de las condiciones experimentales que permitieran realizar estudios funcionales. Se observó que la expresión continuada de la quinasa CK2 inactiva provocaba un fenotipo deletéreo en las plántulas, afectando al desarrollo de los cloroplastos, a la expansión celular y al crecimiento de raíz y hojas. La inducción prolongada del transgén era letal. Además, las semillas germinadas en oscuridad presentaban un aparente fenotipo de-etiolado, que no parecía estar causado por un fallo en la señalización por luz. Sin embargo, inducciones cortas de la quinasa inactiva permitían la supervivencia de la planta, pero afectaban significativamente al crecimiento de la raíz y a la formación de las raices laterales. A nivel transcripcional, la falta de actividad CK2 provocaba grandes cambios en los patrones de expresión de genes implicados en un amplio rango de procesos celulares, como la fotosíntesis, la traducción, el crecimiento celular o el desarrollo embrionario. La división celular también se veía afectada, evidenciado por los cambios en la expresión de genes relacionados con ciclo celular y corroborado por el patrón de expresión de CYCB1::GFP en los meristemos radiculares. Estos resultados serían consistentes con el papel esencial de la CK2 en procesos celulares básicos y en la viabilidad celular.
La participación de la quinasa CK2 en los múltiples procesos que engloban la respuesta a daño en el DNA centra el interés de la segunda parte del trabajo. La reparación del DNA requiere la coordinación temporal de un elevado número de procesos relacionados, como la activación transcripcional de genes de reparación, el arresto del ciclo celular, o la modificación de la estructura de la cromatina. En animales es conocido que la proteína quinasa CK2 está involucrada en las respuestas a daño en el DNA. En este trabajo de tesis demostramos que, fenotípicamente, la falta de CK2 confiere hipersensibilidad a un amplio rango de genotóxicos que producen diferentes tipos de lesiones (rayos gamma, UV-C, metilmetanosulfonato). El estudio de la fosforilación radioinducible de la histona H2AX y de la respuesta transcripcional de genes radiomodulados muestra que la deficiencia en actividad CK2 no parece afectar significativamente ni a la percepción del daño ni a la señalización para la activación de la respuesta. Por otra parte, la eficiencia de reparación del DNA, estudiada mediante ensayos de comet y por medio de un sustrato recombinogénico para la via particular de recombinación homóloga, aparece afectada significativamente en las plantas mutantes. Además, la falta de actividad CK2 produce cambios en la estructura de la cromatina y en el silenciamiento transcripcional. Proponemos que los cambios en la cromatina podrían ser, al menos en parte, responsables de la hipersensibilidad a genotóxicos, lo que evidencia el papel cooperativo entre la reparación del daño en el DNA y la estructura de la cromatina.
