Diagnòstic genètic preimplantacional de malalties hereditàries: fibrosi quística i hemofília
- Autores: Fernando Sánchez García
- Directores de la Tesis: Jordi Benet i Català (dir. tes.), Francisco Vidal Perez (dir. tes.), Joaquima Navarro i Ferreté (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2009
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Carme Fuster Marqués (presid.), Lluis Puig Rovira (secret.), Olga Martínez Pasarell (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Diagnóstico Genético Preimplantacional de enfermedades hereditarias: Fibrosis Quística y Hemofilia Doctorando: Jorge Fernando Sánchez García En las últimas décadas el diagnóstico prenatal ha sido aplicado en parejas con un riesgo elevado de transmitir una enfermedad genética a su descendencia. Esta técnica implica, por lo tanto, que en caso de detectar un feto afectado, los progenitores tienen dos alternativas: seguir adelante con el embarazo (pese a la afectación del feto) o el aborto terapéutico.
Más recientemente, las técnicas de reproducción asistida han permitido una aproximación mucho más temprana que el prenatal, el llamado Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP), que se basa en el estudio de biopsias de embriones, las cuales nos permiten seleccionar únicamente los embriones sanos para su transferencia de nuevo al útero materno. El DGP precisa de técnicas de fecundación in vitro y puede ser aplicado en dos estadios diferentes, en el primer corpúsculo polar de ovocitos maduros o en blastómeros de embriones. Para el estudio de anomalías cromosómicas en parejas portadoras de reorganizaciones o en mujeres de edad avanzada se aplican técnicas de hibridación in situ fluorescente (FISH). En el caso de parejas portadoras de enfermedades genéticas, el análisis se realiza básicamente con PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Las enfermedades genéticas están causadas por mutaciones en su gen responsable, como por ejemplo el gen CFTR de la fibrosis quística. La fibrosis quística es la enfermedad genética autosómica recesiva más frecuente y afecta aproximadamente a uno de cada 2500 recién nacidos. Se caracteriza por un aumento de iones cloruro en el sudor y por obstrucción pulmonar y pancreática. Otro ejemplo de enfermedades monogénicas serían las hemofilias A y B causadas por mutaciones en los genes de los factores de coagulación FVIII y FIX, respectivamente. Las hemofilias se deben a la alteración o ausencia de actividad de uno de estos factores de coagulación. Presentan una herencia recesiva ligada al cromosoma X y su incidencia aproximada es de 1 de cada 10000-30000 barones.
El DGP de estas enfermedades monogénicas se basa en la identificación de embriones libres de las mutaciones que llevan sus progenitores y muchas veces precisan de la puesta a punto de protocolos específicos de paciente, muy costosos de optimizar. Además, la PCR de una única célula presenta numerosas dificultades técnicas debido a la cantidad mínima de DNA de la cual se parte, siendo la no amplificación de la célula y la contaminación de la muestra dos de los problemas más frecuentes que dificultan el diagnóstico. Por tanto, es muy necesario utilizar técnicas de gran sensibilidad, que nos permitan confirmar el diagnóstico y detectar los casos de contaminación.
En este trabajo se ha puesto a punto un método de amplificación total del genoma en células aisladas a fin de aumentar la cantidad de DNA en la que poder realizar el diagnóstico. Este DNA preamplificado nos permite analizar e identificar mediante un solo protocolo basado en técnicas moleculares con marcaje fluorescente, la presencia o ausencia de hasta 31 mutaciones diferentes responsables de fibrosis quística. En el caso de la hemofilia, la secuenciación del DNA preamplificado nos permite identificar cualquier mutación de tipo substitución, pequeña inserción o deleción en el promotor, exones o regiones intrónicas flanqueantes tanto del gen F8 como del F9. Además, se han optimizado unas PCRs multiplex fluorescentes de marcadores de tipo microsatélite (STR) diseñadas para confirmar el diagnóstico mediante el análisis indirecto adicional de las mutaciones y, simultáneamente, detectar la posible contaminación de las muestras en la aplicación clínica del DGP. La metodología desarrollada presenta una gran robustez y puede ser aplicada en más del 80% de las parejas portadoras a nivel mundial, sin la necesidad de poner a punto protocolos específicos para esos pacientes. La estrategia diagnóstica utilizada seria transferible a muchas otras enfermedades y facilitaría el desarrollo de protocolos de DGP versátiles de elevada fiabilidad.
