Resumen de Estudis estructurals i funcionals de les quinona oxidoreductases humanes pig3 i zeta-cristal·lina
Aquesta Tesi s'emmarca en la caracterització estructural i funcional de proteïnes de la superfamília de les deshidrogenases de cadena mitjana (MDR), que es poden dividir principalment en dos grups: les MDR dependents de Zn i les MDR independents de Zn. Fins ara, el nostre grup s'havia centrat en l'estudi de les MDR dependents de Zn i especialment en les alcohol deshidrogenases (ADH), que conformen una de les famílies de proteïnes més extensament caracteritzades. Amb el propòsit de millorar el coneixement de les MDR independents de Zn, es varen iniciar els estudis en dues proteïnes humanes: PIG3 i zeta-cristal¿lina, que pertanyen a un grup de proteïnes molt poc estudiat: les quinona oxidoreductases (QOR). D'aquesta forma, la Tesi es divideix en dos capítols, cadascun centrat en una de les proteïnes objecte d'estudi.
La primera part de la Tesi es centra en l'estudi de la quinona oxidoreductasa induïble pel factor de transcripció p53 (PIG3). Els treballs publicats sobre PIG3 s'havien centrat en la caracterització de la seva expressió i en l'estudi del seu promotor induïble per p53. Aquests treballs indicaven la implicació d'aquesta proteïna en l'apoptosi, a través de l'increment de l'estrès oxidatiu mitjançant la seva hipotètica activitat quinona oxidoreductasa, que generaria espècies reactives d'oxigen (ROS), una activitat enzimàtica encara no demostrada. Així, la Tesi es va iniciar amb la caracterització in vitro de l'activitat enzimàtica en front de diferents tipus de substrats, demostrant, per primera vegada, activitat dependent de NADPH diamida reductasa i quinona oxidoreductasa. Aquesta última generava peròxid d'hidrogen. Per una altra banda, en col¿laboració amb el grup dirigit pel Dr. Ignasi Fita (Institut de Biologia Molecular de Barcelona IBMB-CSIC) i el grup del Dr. Udo Oppermann (Structural Genomics Consortium, Oxford, Regne Unit) es va resoldre l'estructura tridimensional del complex binari de PIG3 amb NADP+, per cristal¿lografia i difracció de raigs X. Aquesta és la primera estructura resolta de la subfamília (o família) de PIG3, i ens va permetre determinar el centre d'unió del cofactor i el centre d'unió del substrat. La cerca de proteïnes homòlogues en altres espècies va confirmar la importància de les posicions identificades per l'anàlisi estructural. Amb el propòsit de determinar el mecanisme catalític i d'inactivar enzimàticament PIG3, per demostrar la implicació de la seva activitat enzimàtica en la generació de ROS, es van iniciar estudis de mutagènesi dirigida. Es va mutar el residu Tyr 51, equivalent a Tyr 59 de zeta-cristal¿lina, i que podria jugar un paper catalític en l'activitat quinona oxidoreductasa; i el residu Ser 151, localitzat en una regió d'interacció amb el cofactor. Les variants de la Tyr 51 de PIG3 i Tyr 59 de zeta-cristal¿lina (Tyr51/59Phe i Tyr51/59Ala) no recolzen que aquests residus actuen com aminoàcid catalític essencial. De la mateixa forma que s'ha descrit per a altres enzims utilitzen quinones com substrats, l'activitat quinona oxidoreductasa d'aquestes dues proteïnes no sembla necessitar d'una catàlisi química. En el cas del mutant Ser151Val, aquest era totalment inactiu per la seva incapacitat d'unir NADPH. La seva transfecció en cèl¿lules humanes HCT-116 no incrementava el peròxid d'hidrogen, demostrant-se la necessitat d'una PIG3 activa per incrementar els nivells de ROS.
La segona part de la Tesi es centra en la zeta-cristal¿lina humana, proteïna encara no caracteritzada. Fins ara, tots els treballs s'havien centrat en zeta-cristal¿lines d'espècies on és sobreexpressada en el cristal¿lí, on podria jugar un paper estructural. En aquest treball s'ha caracteritzat la seva activitat quinona oxidoreductasa i, a més, s'ha identificat una nova activitat: la reducció del doble enllaç en posició ¿,ß respecte a un grup carbonil. Aquesta activitat havia estat descrita per a les alquen-al/ona reductases (AOR), família de les MDR independents de Zn, però no per a les QOR. L'anàlisi de la seva estructura tridimensional, resolta i dipositada pel grup del Dr. Udo Oppermann (Structural Genomics Consortium, PDB ID 1YB5), ha permès descriure la zeta cristal¿lina com un enzim tetramèric i suggerir la Tyr 53 com un aminoàcid important per a la catàlisi de l'activitat de reducció dels dobles enllaços. L'estudi del mutant Tyr53Phe ha corroborat la participació d'aquest aminoàcid en la catàlisi, encara que no de forma essencial. Tal com s'indica anteriorment no s'ha identificat cap residu catalític per l'activitat amb quinones.
Finalment, s'ha demostrat la capacitat de la zeta-cristal¿lina humana d'interaccionar amb elements rics en adenina-uracil (ARE) del RNA, els quals són seqüències localitzades en els extrems 3' no codificants (3'UTR) de determinats mRNA. Aquesta interacció implica el lloc d'unió del cofactor, tal i com ho demostra el fet que el NADPH interfereix la unió del RNA.
