Resumen de Control of nucleotide homeostasis and genomic integrity in Trypanosoma brucei: role of hd nucleotidases and base excision repair
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Trypanosoma brucei es un parásito protozoario de la clase Kinetoplástida, agente causal de la tripanosomiasis humana africana (HAT) o comúnmente conocida como la “enfermedad del sueño”. La transmisión está mediada por la picadura de la mosca tsetsé (del género Glossina) y tanto parásito como vector se localizan mayoritariamente en el África subsahariana. Tras el desarrollo de numerosas iniciativas enfocadas al control de la enfermedad, el número de nuevos casos ha disminuido considerablemente, registrándose tan solo 977 casos en 2018 (WHO 2019). Sin embargo, a pesar de estos datos prometedores, los tratamientos disponibles siguen siendo escasos y muy tóxicos, y el desarrollo de resistencias constituye un inconveniente adicional (Buscher et al. 2017). Por esta razón, el descubrimiento de nuevos blancos de acción sigue siendo prioritario para mejorar la terapia contra la enfermedad. Por otra parte, T. brucei constituye un organismo modelo para el estudio de la biología de kinetoplástidos. La disponibilidad de sofisticadas herramientas de manipulación genética unido a la facilidad de cultivo y mantenimiento hacen de este organismo un paradigma para el estudio de la biología de organismos eucarióticos unicelulares.
En todos los organismos la preservación de la integridad genómica es esencial, y en concreto, el correcto mantenimiento de los niveles de los nucleótidos (dNTPs) posee un papel primordial. De hecho, desequilibrios en el “pool” de dNTPs da lugar a procesos que comprometen gravemente la viabilidad celular, como genotoxicidad, mutagénesis o tumorogénesis (Kohnken et al. 2015). De esta manera, los componentes del metabolismo de nucleótidos pueden suponer una fuente importante de dianas terapéuticas. Los dNTPs pueden ser sintetizados en la mayoría de organismos por dos rutas metabólicas, la vía de recuperación de nucleósidos pre-formados y la síntesis de novo (Wang 2016). Mientras que T. brucei carece de las enzimas necesarias para sintetizar purinas de novo, es capaz de sintetizar los nucleótidos de pirimidina por ambas vías. A pesar de esta aparente redundancia metabólica para la generación de precursores pirimidínicos, ciertas enzimas implicadas en la biosíntesis del timidilato, como la dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa (DHFR-TS), timidina kinasa (TK), desoxiuridina trifosfato hidrolasa (dUTPasa) o la citidina desaminasa (CDA), han demostrado ser esenciales para la viabilidad del parásito (Sienkiewicz et al. 2008; Castillo-Acosta et al. 2013; Leija et al. 2016; Valente et al. 2016). En concreto, líneas de T. brucei deficientes en TK no son viables y acumulan nucleósidos intracelulares tanto en ausencia como en presencia de un aporte exógeno de nucleósidos. Por otra parte, se ha demostrado que la fosforilación de la desoxiuridina (procedente de la desaminación de la desoxicitidina) via TK es un paso esencial en la síntesis de timidilato. Estas observaciones plantean la hipótesis de que T. brucei expresa nucleotidasas implicadas en la formación de nucleósidos intracelulares esenciales para la síntesis de timidilato. Por esta razón, el objetivo principal de esta tesis fue la identificación de dNTPasas en T. brucei que pudieran estar implicadas en este proceso.
En un esfuerzo por caracterizar nucleotidasas en el genoma de T. brucei, se han identificado dos nucleotidohidrolasas que contienen un dominio “histidine-aspartic acid” (HD) y que están relacionadas con la proteína humana “sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1” (SAMHD1), que es una trifosfato desoxinucleósido (dNTP) hidrolasa que juega un papel esencial en la homeostasis de dNTPs/nucleósidos a lo largo del ciclo celular. Los dos parálogos identificados en Trypanosoma exhiben un dominio HD altamente conservado pero carecen del dominio SAM, y se denominaron TbHD52 y TbHD82. En este trabajo, se ha evaluado el papel de estos ortólogos en viabilidad celular y control de la homeostasis de nucleótidos. Ambas proteínas mostraron una localización diferencial, así como un diferente impacto sobre la proliferación celular. Mientras que TbHD82 era nuclear y prescindible, TbHD52 demostró ser una proteína mitocondrial esencial para la viabilidad, y células “knock-out” para la enzima son auxótrofas para timidina. La expansión del “pool” de dTMP en líneas deficientes en TbHD52, ya sea por suplementación del medio con nucleósidos de pirimidina o por la complementación con la enzima dCMP desaminasa humana, revierte el fenotipo deletéreo. Las observaciones obtenidas indican que TbHD52 tiene un papel central en la provisión de desoxinucleósidos pirimidínicos necesarios para la división celular. Asimismo, la ausencia de TbHD52 induce graves defectos en la progresión del ciclo celular, caracterizado por una parada en las fases S y G2/M y por la aparición de poblaciones aberrantes en cuanto al número y apariencia de núcleos y kinetoplastos. La cuantificación de dNTPs junto con un análisis metabolómico global de las líneas TbHD52-nulas puso de manifiesto profundas modificaciones en el perfil de precursores pirimidínicos, caracterizadas por una acusada acumulación de dCTP y derivados de citidina, así como una depleción significativa de dTTP y derivados de timidina. Estos resultados, junto con la intensa activación de foci nucleares de ɣH2A, un marcador temprano de daño en el DNA, sugieren que TbHD52 tiene un papel central en la homeostasis de dNTPs y en el abastecimiento de la desoxicitidina y timidina destinadas a la biosíntesis de timidilato.
Adicionalmente, a pesar de la estricta regulación de los niveles de dNTPs, en el DNA se producen constantemente lesiones derivadas del metabolismo endógeno o de agentes externos, los cuales pueden causar importantes daños como mutaciones o fragmentación (Chatterjee and Walker 2017). De hecho, durante el proceso de infección en el torrente sanguíneo, los parásitos están especialmente expuestos a estrés oxidativo por la acción del sistema inmune. Para contrarrestar esta situación y preservar la integridad genómica, las células activan múltiples mecanismos de reparación, entre los cuales destaca la ruta de reparación de DNA por escisión de bases (BER). La enzima uracil-DNA glicosilasa (UNG), inicia la ruta de BER ante la presencia de uracilo en el DNA (Jacobs and Schar 2012). En este contexto, durante la respuesta inmune primaria, el óxido nítrico (NO) es liberado por los fagocitos, y en combinación con los radicales de oxígeno producen especies reactivas de nitrógeno que reaccionan con el DNA, generando roturas de cadena y bases modificadas (incluyendo desaminaciones de citosina), los cuales son sustratos para la UNG (Fang 1997). Estudios previos han demostrado la importancia de UNG para la virulencia de T. brucei (Castillo-Acosta et al. 2012), por lo que en esta tesis se ha profundizado en el daño en el DNA que se genera en respuesta al estrés oxidativo durante la interacción entre el patógeno y el huésped in vivo. Se ha analizado el contenido en uracilo y sitios abásicos en el DNA, así como la cantidad de foci de ɣH2A tanto in vitro, tras el tratamiento con donadores de NO, como in vivo, en parásitos aislados tras infección en modelos murinos. Los resultados ponen de manifiesto la aparición de daño genotóxico en T. brucei tras la exposición al NO in vitro y muestra que la ausencia de UNG genera mayores niveles de daño en el DNA. Por otra parte, los parásitos recuperados de ratones exhiben niveles más altos de roturas de cadenas de DNA, desaminación de bases y focos de reparación en comparación con las células cultivadas in vitro, y la ausencia de UNG conduce a un mayor daño del DNA también en infecciones animales. Estas observaciones sugieren que la respuesta inmune desarrollada por el huésped genera estrés oxidativo y daño en el DNA del parásito y enfatiza la importancia de BER en la protección contra el estrés genotóxico y oxidativo en T. brucei.
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The first aim of this research was the identification of HsSAMHD1 orthologues in T. brucei, as well as the evaluation of their role in cell viability and homeostasis of pyrimidine dNTPs. To this purpose, the following specific objectives were proposed: 1. Identify potential HsSAMHD1 orthologues in T. brucei with a predicted dNTPase activity and determine their intracellular localization. 2. Evaluate the role of HsSAMHD1 orthologues in cell viability and cell cycle progression. 3. Establish the role of the identified dNTPases in the supply of pyrimidine and purine nucleosides. 4. Analyze the contribution of dNTPases to pyrimidine and thymidylate biosynthesis. 5. Determine the impact of perturbations in dNTP hydrolysis on genomic integrity. DNA lesions can derive from polymerase action during replication or external agents that modify DNA bases, which can lead to severe damage, such as mutations, DNA breaks or AP sites. In the case of T. brucei, during infection parasites are especially exposed to an intense oxidative stress as a result of the response of the immune system. In order to counteract this situation and sustain genomic integrity, cells trigger multiple repair mechanisms. Previous studies conducted in the lab have already demonstrated the importance of UNG for T. brucei infectivity, as UNG-deficient parasites showed reduced virulence. Thus, a second general aim of this thesis was to analyze the occurrence of oxidative stress and the activation of DNA repair pathways during host-pathogen interactions in vivo. The following specific objectives were proposed: 1. Evaluate the impact of oxidative stress on DNA integrity in T. brucei BSFs exposed to genotoxic compounds in vitro. 2. Analyze the consequences on parasites of the potential oxidative stress that arises upon murine infection and the activation of a DNA damage response. 3. Determine the relevance of UNG and the BER pathway in counteracting DNA damage produced by oxidative stress.
