Resumen de Structural and stability studies of class a g-protein coupled receptors
Receptors acoblats a proteïna G (GPCRs) són proteïnes integrals de membrana que intervenen diferents tipus de senyals en les respostes químiques, a causa d'aquestes propietats GPCRs exercir un paper fonamental en diverses malalties que són objecte de més del 30% de tots els medicaments produïts per companyies farmacèutiques. Estudis estructurals de GPCRs són un repte perquè solen ser inestables en solucions de detergent i també la seva escassa disponibilitat, per les seves baixos nivells d'expressió. En aquest treball abordarem alguns aspectes clau de GPCRs com ara l'estabilitat i estructura en dues GPCRs: rodopsina i el receptor muscarínic subtipu M3. Hem investigat el paper de les sals en l'estabilitat de la rodopsina, en primer lloc es van seleccionar de carbonat de liti a causa de les característiques especials d'aquesta sal per tractar els trastorns bipolars i l'estat d'ànim i el mecanisme involucrat en les seves accions terapèutiques i els efectes tòxics no està clara. Hem observat que Li+ a concentracions terapèutiques (1.2 Mm) genera un efecte desestabilitzador sobre el medi ambient retina cromòfor en el seu estat fosc i la inestabilitat a nivell d'estructura secundària. Els nostres resultats suggereixen que les concentracions de carbonat de liti, utilitzat en alguns pacients en tractament, podria tenir algun efecte sobre el sistema visual en el pla fotoreceptor rodopsina. Durant el segon estudi relacionat amb els efectes de la sal a rodopsina hem provat l'efecte d'altes concentracions de sal sobre l'estabilitat de la rodopsina per blanqueig tèrmic, calorimetria i dicroisme circular, la recerca d'un efecte específic de sodi amb una tendència a l'estabilització de suposar que en afavorir las inteaccions hidrofòbicas. Creiem que aquest efecte podria ser prorrogat per altres GPCRs i ser explotats en els estudis estructurals per una combinació amb altres mètodes d'estabilització. El que fa als aspectes estructurals de GPCRs, es va verificar un dels mecanismes proposats per l'existència d'un canal lligand contínua dins d'opsina mitjançant mutagènesi dirigida, supressió dels anells aromàtics dels residus Y43, F293 i F276 de l'observació que només F276 és important per a la alliberament del tot-trans-retinal, mentre els residus Y43, F293 no juguen cap paper en la presa de fins al lligand, en contra d'un dels mecanismes proposats en la literatura. Finalment, es va clonar en un vector d'expressió procariota pGEX-3X i sobreexpressat en Escherichia coli (BL21) el tercer bucle intracelular del receptor muscarínic subtipu M3 i es purifica mitjançant cromatografia d'afinitat amb la proteïna GST com una etiqueta de purificació i de garantir la seva expressió. Un cop purificada es va utilitzar la nansa d'estudis estructurals a la Circular dicroisme per tal d'observar si aquest element estructural dels receptors muscarínics té una estructura ordenada, trobant que i3 bucle té 7,7% de l'hèlix, el 40,2% de la cadena ß, el 12,6% de la volta i el 39,4 % de l'estructura desordenada. Aquestes observacions apunten a una funció específica en l'acoblament estructural de la proteïna del receptor-G i la formació de complexos, el que suggereix que els llocs d'interacció amb altres proteïnes citosòliques són els que tenen una estructura definida i no per regions no estructurats dins del tercer bucle intracelular.
