Polimerasas de rna y su papel en el silenciamiento génico mediado por rna en mucor circinelloides
- Autores: Silvia Calo Varela
- Directores de la Tesis: Santiago Rafael Torres Martínez (dir. tes.), Rosa María Ruiz Vazquez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Murcia ( España ) en 2010
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Vicente Pallás Benet (presid.), Francisco E. Nicolás Molina (secret.), Montserrat Elías-Arnanz (voc.), Eduardo Antonio Espeso Fernández (voc.), César Llave Correas (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El silenciamiento génico mediado por RNA (RNA silencing) actúa mediante mecanismos transcripcionales y postranscripcionales para suprimir, de forma específica, la expresión génica de genes diana. En eucariotas superiores, este mecanismo está implicado en una amplia variedad de procesos biológicos, incluyendo la defensa frente a virus, transposones y transgenes, la regulación de la expresión génica y la formación de la heterocromatina. El control de estos procesos está mediado por pequeñas moléculas de RNA, siRNAs o miRNAs, que son generados por la enzima Dicer a partir de precursores de RNA de doble cadena (dsRNA). Los pequeños RNAs son incorporados en complejos multiproteicos, donde sirven de guía para identificar moléculas de RNA con secuencias complementarias, provocando la inhibición de su transcripción, el bloqueo de su traducción o su degradación. Las moléculas de dsRNA que activan el mecanismo pueden ser originadas por complementariedad interna o por la actuación de una polimerasa de RNA dependiente de RNA (RdRP). Además, pequeñas cantidades de la molécula inductora son capaces de activar eficazmente la maquinaria de silenciamiento debido a la existencia de un proceso de amplificación, llevado a cabo por otra enzima RdRP, que genera nuevas moléculas de dsRNA utilizando como molde el mRNA diana, realimentando así el mecanismo.
En el hongo zigomiceto Mucor circinelloides, la introducción de transgenes exógeno del gen carB, utilizado como chivato del silenciamiento, conduce a la supresión de la expresión de dicho gen por degradación de su mRNA. Los transformantes silenciados acumulan moléculas de siRNA, con sentido (25 nt) y antisentido (21 y 25 nt), correspondientes a secuencias del gen carB. Sin embargo, no se había demostrado si el mecanismo de silenciamiento identificado en M. circinelloides era un mecanismo canónico activado por moléculas de dsRNA. Gracias al diseño de transgenes con ¿repeticiones invertidas¿ del gen carB, capaces de producir, tras su transcripción, una horquilla de RNA, se comprobó que, efectivamente, el silenciamiento génico en M. circinelloides sigue un mecanismo canónico, actuando el dsRNA como activador del mecanismo de una forma más eficaz que los transgenes ¿con sentido¿, y siendo más estables los transformantes silenciados con este tipo de moléculas.
2 Si el dsRNA es un intermedio del mecanismo de silenciamiento, debe existir en M.
circinelloides al menos una RdRP capaz de sintetizar la cadena complementaria de los transgenes en copia única, convirtiéndolos en dsRNA, molécula que activaría la ruta.
Utilizando oligonucleótidos degenerados, diseñados a partir de la secuencia de los genes rdrp de Rhizopus oryzae, un zigomiceto muy próximo filogenéticamente a M. circinelloides, se consiguió clonar un fragmento del gen rdrp1 de este hongo. El rastreo de una genoteca genómica de M. circinelloides con el fragmento amplificado permitió aislar el gen rdrp1 completo y las regiones genómicas adyacentes. Una vez obtenida la secuencia completa del gen se llevó a cabo su caracterización estructural.
Para realizar el análisis funcional del gen rdrp1 se obtuvo una estirpe mutante rdrp1- mediante disrupción génica. Con el fin de determinar si este mutante estaba afectado en la ruta de silenciamiento, se transformó con el plásmido que contiene un transgen ¿con sentido¿ (en copia única) del gen carB y con el que contiene ¿repeticiones invertidas¿, produciendo una horquilla de RNA del mismo gen por complementariedad interna. Los resultados de la transformación del mutante rdrp1- y de la estirpe silvestre revelaron la incapacidad del mutante para activar el mecanismo de silenciamiento cuando se utilizaban como inductores transgenes ¿con sentido¿. Sin embargo, la utilización de transgenes con ¿repeticiones invertidas¿ permitió obtener transformantes silenciados, aunque con una eficacia menor que en la estirpe silvestre.
Esto apunta a un papel fundamental del gen rdrp1 en la inducción del silenciamiento, siendo probablemente la enzima responsable de convertir las moléculas de ssRNA derivadas de los transgenes ¿con sentido¿ en dsRNA. La estabilidad del silenciamiento y la producción de siRNAs del gen carB en los transformantes silenciados obtenidos con la horquilla de RNA en la estirpe mutante rdrp1- son similares a las de la estirpe silvestre, lo que apoya la hipótesis anterior.
Como el gen rdrp1 no tiene un papel importante en el proceso de amplificación de la señal de silenciamiento, se localizó un segundo gen, el rdrp2, en la secuencia genómica de M.
circinelloides que había sido puesta a disposición pública en ese momento. Este gen fue sometido a la misma caracterización estructural y análisis funcional que en el caso del rdrp1.
En este caso se observó una reducción drástica en la eficacia de silenciamiento en la estirpe mutante rdrp2-, tanto si éste se inducía por transgenes ¿con sentido¿ como si se utilizaban transgenes ¿con repeticiones invertidas¿, además de una bajísima estabilidad del silenciamiento en estos transformantes. Esto sugiere que el papel del gen rdrp2 debe ser común para ambos tipos de inductores y muy importante para el mantenimiento del mecanismo de silenciamiento, por lo que lo más probable es que esté relacionado con el proceso de amplificación.
3 A continuación se buscaron nuevos genes implicados en el mecanismo de silenciamiento génico, lo que llevó a la identificación de un gen que cifraría una proteína con dos dominios de unión a dsRNA, al que se denominó r2d2. Tras su caracterización estructural se llevó a cabo, de nuevo, un análisis funcional, estudiando el mecanismo de silenciamiento en el mutante r2d2-. La participación de este gen en el mecanismo de silenciamiento génico se confirmó al observar una disminución en la frecuencia de silenciamiento del mutante r2d2- con respecto a la estirpe silvestre. Los valores similares obtenidos con los distintos tipos de transgenes sugieren que este gen está implicado en un paso común a las distintas moléculas inductoras. Al no verse afectado el mutante en la estabilidad del silenciamiento ni en su capacidad de producción de siRNAs, probablemente ese paso común esté relacionado con la activación del silenciamiento.
Una gran parte de este trabajo ha estado dedicada a la identificación y caracterización de dos genes rdrp. Para una mejor comprensión de la función de las proteínas RdRP en el mecanismo de silenciamiento, así como para conocer el posible papel de estas proteínas en la regulación de funciones endógenas, se procedió a la clonación, secuenciación y caracterización de los pequeños RNAs acumulados endógenamente en los mutantes para los dos genes rdrp de M. circinelloides y su comparación con los que se acumulan en la estirpe silvestre. Datos previos de nuestro laboratorio demuestran que en M. circinelloides la ruta de silenciamiento canónica es capaz de regular funciones endógenas, además del silenciar transcritos exógenos.
Esta ruta regula la expresión de genes endógenos mediante la producción de sRNAs generados, principalmente, por la enzima Dicer2. Gracias al análisis realizado durante esta tesis, se ha revelado también la participación, en este proceso, de las proteínas RdRP1 y, en menor medida, RdRP2.
Una proporción importante de sRNAs derivados de exones identificados en este trabajo son dependientes de las RdRPs, pero independientes de Dicer, por lo que, al no precisar de un procesamiento por esta endonucleasa, deberían ser producidos por una ruta diferente al mecanismo de silenciamiento canónico. El análisis de esta clase de sRNA indica que son productos de degradación, pues tienen polaridad con sentido y muestran una distribución homogénea en el rango de tamaños secuenciado, sin detectarse un tamaño mayoritario. Al estudiar los loci de los que preceden estos sRNAs, se observó que el proceso de degradación debía estar participando activamente en la regulación de la expresión génica, ya que existe un aumento en la acumulación de mRNA de los genes diana en los mutantes rdrp-. Estos loci diana corresponden a genes que cifran proteínas metabólicas, y la mayoría se expresan a niveles muy elevados. Los resultados obtenidos revelan, por tanto, la existencia de una nueva 4 ruta de degradación de mRNA, que depende de los genes rdrp y que regula la expresión de genes endógenos.
