Estudio in vitro de la inestabilidad de repeticiones en el dna por errores de replicacion del tipo deslizamiento de hebra
- Autores: Mellissa Gissel Castillo Lizardo
- Directores de la Tesis: Enrique Viguera Mínguez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Málaga ( España ) en 2010
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Luis Blanco Dávila (presid.), José Lozano Castro (secret.), Luis Menéndez Arias (voc.), Miguel Ángel Medina Torres (voc.), Marie-Agnès Petit (voc.)
- Materias:
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- Resumen
TÍTULO DE LA TESIS: ESTUDIO in vitro DE LA INESTABILIDAD DE REPETICIONES EN EL DNA POR ERRORES DE REPLICACIÓN DEL TIPO DESLIZAMIENTO DE HEBRA La secuencias de DNA repetidas están presentes en los tres dominios de la vida, siendo particularmente abundantes los genomas de organismos eucariontes, constituyendo alrededor de un 55% del genoma humano. Su complejidad varia desde repeticiones de mono, di y tri-nucleótidos, hasta genes completos. Estas secuencias están frecuentemente asociadas a puntos calientes de mutación e inestabilidad genómica, consistente en la pérdida o ganancia de unidades repetidas. La inestabilidad de secuencias de DNA repetidas está vinculada a más de 40 enfermedades neurológicas, neurodegenerativas y neuromusculares en humanos. La capacidad intrínseca de las secuencias repetidas de adoptar estructuras secundarias juega un papel muy importante en su inestabilidad, como consecuencia del procesamiento por la maquinaria de replicación y/o reparación celular.
En esta Tesis hemos estudiado la inestabilidad de repeticiones como consecuencia del error de replicación por deslizamiento de hebra. Para ello hemos realizado ensayos de extensión de cebador sobre moldes de DNA conteniendo una estructura en horquilla flanqueada por dos repeticiones directas, que mimetizan la replicación en la hebra retrasada. Por otro lado no se han detectado moléculas expandidas por deslizamiento de hebra en el sistema experimental utilizado. Nuestros resultados muestran que las dos DNA polimerasas replicativas de la arquea Pyrococcus abyssi(Pab), Pol B y Pol D, generan deleciones por deslizamiento de hebra. Además PCNA, la abrazadera deslizante de Pao, inhibe el error por deslizamiento de hebra de Pol B. Por otro lado, los modos de unión de la proteina de unión a DNA de hebra simple (SSB) de Escherichia coli afectan a la generación de errores de replicación por deslizamiento de hebra de la T7 DNA polimerasa (T7 pol) pero no de la T4 DNA polimerasa (T4 pol). Este efecto parece ser específico de la interacción SSB-T7 pol puesto que no se detectó ningún efecto de la SSB del bacteriófago T4 (gp 32) en el error por deslizamiento de hebra de T7 pol.
Además, SSB en el modo de unión SSB(56), estimula la actividad de desplazamiento de hebra de T7 pol, siendo esta activación la responsable de la inhibición del error por deslizamiento de hebra de T7 pol en presencia de SSB. Por lo tanto, el modo de unión de SSB al DNA puede estimular la fidelidad de replicación de secuencias repetidas de la T7 pol. Además, hemos visualizado por microscopía de fuerza atómica, los cambios del modo de unión de SSB a un DNA molde conteniendo una estructura en horquilla, promovidos por un incremento en la concentración de cloruro de magnesio. Por otro lado, hemos observado que la concentración de magnesio en la reacción afecta a la actividad de desplazamiento de hebra y tiene un efecto sobre el error por deslizamiento de hebra de polimerasas mesófilas y termófilas que poseen esta actividad.
Adicionalmente, hemos estudiado el papel de las DNA polimerasas humanas 5, 8 y n en la replicación de DNA moldes conteniendo estructuras en horquilla. Pol ó es capaz de replicar a través de una estructura en horquilla con una eficiencia moderada, a diferencia de la polimerasa B humana, que se bloquea temporalmente en la base de la horquilla, aunque, en base al estudio de la cinética de la reacción, es capaz de extender estos productos bloqueados. Pol \i, dependiendo del contexto de secuencia, genera expansiones cuando replica una estructura en horquilla, posiblemente por dislocación del molde. El mutante de pol u (R387K), afectado en la regulación de la actividad transferasa terminal, genera mayores expansiones que la forma silvestre cuando replica un molde conteniendo una estructura en horquilla. Además, las formas silvestre y mutante de pol \i replican de forma similar un molde con una estructura en horquilla o con un gap.
Por último, no se han detectado molécqlas expandidas por deslizamiento de hebra en el sistema experimental utilizado, sugiriendo que las expansiones en el DNA podrían producirse por un mecanismo diferente al deslizamiento de hebra tras la disociaciónd e la DNA polimerasa.
