Strawberry(fragariax ananassa) fruit ripening: auxin signalling, proteomic analysis and eugenol production
- Autores: Irene Aragüez Rey
- Directores de la Tesis: M. Nieves Medina Escobar (dir. tes.), Victoriano Valpuesta (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Málaga ( España ) en 2011
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Fernando Pliego Alfaro (presid.), Miguel A. Botella (secret.), Giorgio Casadoro (voc.), Juan Blanco Muñoz (voc.), Wilfried Schwab (voc.)
- Materias:
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- Resumen
STRAWBERRY (FRAGARIA *ANANASSA) FRUIT RIPENING: AUXIN SIGNALLING, PROTEOMIC ANALYSIS AND EUGENOL PRODUCTION RESUMEN: En esta Tesis, se han examinado tres aspectos del proceso de maduración de los frutos de fresa: 1) la regulación de la señalización de auxinas por el m¡R393 a través de la generación y análisis de diferentes líneas transgénicas, 2) los cambios proteicos que se producen durante la maduración de frutos y de aquenios por electroforesis bidimensional seguida de identificación proteica por MALDI/TOF-TOF, y 3) caracterización de tres enzimas eugenol sintasa involucradas en la producción del compuesto volátil eugenol a través de estudios cinéticos de las proteínas purificadas y de expresión transitoria.
Nuestro estudio de las líneas transgénicas que expresan ectópicamente el pre-AtmiR393a revela claras diferencias entre hojas y frutos en lo que respecta a los perfiles de expresión de genes relacionados con la señalización de auxinas, con cambios claros en hojas, pero sin cambios en frutos. Nuestra conclusión es que la maquinaria para procesar el pre-AtmiR393 o la maquinaria para escindir la diana FaTIRI no es funcional en frutos maduros. Los resultados obtenidos en las plantas de fresa transformadas con 35S::AtATIR1 son también diferentes en hojas y en frutos. En hojas, la disminución de la expresión de FaTIRI endógeno se puede explicar en base al efecto de AtATIRI o los productos de su procesamiento sobre la transcripción de FaTIRI. Sin embargo el efecto de la disminución de la expresión de FaTIRI endógeno no se observa en frutos maduros. Estos resultados parecen indicar que en este órgano, la concentración de auxinas, más que TIR1, podría ser limitante en la respuesta a esta hormona.
Por otro lado, mediante electroforesis bidimensional hemos identificado proteínas de frutos verdes, y de frutos rojos de F. *ananassa cv. Camarosa, acumuladas diferencialmente entre estos dos estadios de maduración. Las diferentes categorías en las que las proteínas identificadas se pueden agrupar están de acuerdo con los procesos que tienen lugar durante la maduración del fruto. Las diferencias proteicas que hemos encontrado entre aquenios verdes (134 proteínas identificadas sólo presentes en aquenio verde) y rojos (174 proteínas identificadas sólo presentes en aquenio rojo) reflejan los cambios fisiológicos que se producen durante el desarrollo y maduración de las semillas. Nuestros resultados, junto con análisis previos de expresión génica y de metabolitos, sugieren que el programa metabólico del aquenio está ampliamente relacionado con la acumulación de compuestos de reserva y protección para preservar la quiescencia de la semilla y asegurar la futura germinación. Además, los cambios que tienen lugar en el proteoma del aquenio reflejan la actividad de este en la síntesis de precursores hormonales y metabolitos secundarios, requeridos para guiar aspectos del desarrollo de la semilla. Finalmente, los resultados de proteómica en relación a las plantas transgénicas de la especie F. vesca que sobreexpresan FaPE1 están de acuerdo con la idea de que en estas plantas el sistema de defensa está reforzado.
Por último, en esta Tesis se presenta la clonación de tres cDNAs cuyas proteínas muestran máxima homología con eugenol sintasas (EGSs) de diferentes especies de plantas. Dos de los cDNAs corresponden a alelos del mismo gen, y por tanto codifican dos formas de la misma enzima (FaEGSIa and FaEGSIb), mientras que el tercero, FaEGS2, codifica una isoenzima diferente. La expresión de estos genes es mayor en F. vesca en comparación con F. xananassa, lo cual se correlaciona con la mayor producción de eugenol que tiene lugar en la especie silvestre. Además, ambos genes presentan perfiles de expresión claramente diferentes a lo largo de la maduración de frutos de fresa, estando FaEGS1a,b fuertemente expresado en aquenios verdes, mientras que la mayor expresión de FaEGS2 se encuentra en receptáculo rojo. La actividad EGS de las enzimas se ha ensayado empleando como sustrato acetato de coniferilo, y NADPH como cofactor. A pesar de la similitud de las secuencias de FaEGSIa y FaEGSIb (sólo seis aminoácidos las diferencian), ambas enzimas muestran comportamientos cinéticos diferentes. Sus curvas de saturación revelan que mientras que la actividad de FaEGSIa aumenta conforme se incrementa la concentración de acetato de coniferilo en las mezclas de reacción hasta al menos 2.5 mM, FaEGSIb presenta inhibición por exceso de sustrato a concentraciones de acetato de coniferilo superiores a 1.1 mM. Resulta interesante que, mientras que a bajas concentraciones de sustrato ambas enzimas presentan un comportamiento de Michaelis-Menten, estas muestran cooperatividad positiva a altas concentraciones de acetato de coniferilo, pero con parámetros cinéticos diferentes. En lo que respecta al comportamiento de FaEGSIa y FaEGSIb frente a NADPH, hemos observado dos comportamientos cinéticos diferentes, hiperbólico y sigmoidal, a baja y alta concentración de sustrato, siendo en ambos casos los parámetros cinéticos frente a NADPH muy similares, lo que indica que la unión del NADPH ocurre de manera análoga en ambas enzimas. Cabe destacar que FaEGS2 cataliza la síntesis cooperativa tanto de eugenol como de isoeugenol, presentando tal y como cabe esperar, valores de [S05] similares frente a acetato de coniferilo para la formación de ambos compuestos. Sin embargo, la velocidad máxima de la reacción que conduce a la formación de eugenol es cinco veces mayor que la de la formación de isoeugenol. Las diferencias entre estas dos actividades de la misma enzima se extienden a los valores de Km para NADPH, la cual es más baja para la actividad EGS. La expresión transitoria de FaEGSIa y FaEGSIb en frutos de fresa confirma su papel como eugenol sintasas.
DIRECCIÓN DEL ARCHIVO EN EL QUE QUEDA LA TESIS: ARCHIVO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD DE MÁLAGA
