Bases genéticas de la inestabilidad de repeticiones en el dna
- Autores: Inmaculada de la Viuda Cuesta
- Directores de la Tesis: Enrique Viguera Mínguez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Málaga ( España ) en 2012
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Josep Casadesús Pursals (presid.), Antonio Flores-Moya (secret.), Guillermo Cueva Méndez (voc.), María Elena Guzmán Cabañas (voc.), Jesús Blázquez Gómez (voc.)
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
Las secuencias de DNA repetidas están asociadas a hotspot de mutación y constituyen una importante fuente de variación genética en numerosos organismos, facilitando la adaptación al ambiente mediante la modulación de la función génica. En esta Tesis Doctoral hemos estudiado en la bacteria modelo Escherichia coli el efecto de la inducción de la respuesta SOS y de la respuesta general a estrés RpoS en la inestabilidad de secuencias repetidas de tipo microsatélite y los mecanismos responsables.
Capítulo 1. Bases genéticas de la inestabilidad de microsatélites en el genoma de Escherichia coli en condiciones de inducción constitutiva de SOS Para el estudio de las bases genéticas de la inestabilidad de microsatélites en un contexto cromosómico, hemos utilizado como sistema experimental un gen lacZ con una serie de repeticiones (AC)n insertadas en fase. Las mutaciones de cambio de pauta de lectura inactivan el gen lo que permite calcular la frecuencia de mutación. Hemos identificado que las DNA polimerasas de translesión (DNA Pols TLS), Pol II, Pol IV y Pol V, codificadas por los genes polB, dinB y umuCD respectivamente, son responsables en parte del aumento de la inestabilidad de repeticiones (AC)30 en condiciones de inducción de SOS en cultivos en placa. Adicionalmente, mediante el uso de alelos de dinB afectados en diferentes funciones celulares, hemos identificado que la interacción de DinB con el ß-clamp es un requisito indispensable para generar inestabilidad de repeticiones, sin embargo mutantes catalíticos de DinB presentan un aumento de inestabilidad de las repeticiones (AC)30.
Por otro lado, hemos estudiado el papel de RecA, RecBCD y RecF, como elementos implicados en la reparación del DNA vía recombinación, en la inestabilidad de las repeticiones (AC)30. Nuestros resultados muestran que RecA y RecBCD mantienen la estabilidad de las repeticiones (AC)30, sugiriendo un papel protector en la célula, mientras que en las mismas condiciones experimentales RecF participa en la inestabilidad de las repeticiones mediada por SOS. Nuestros datos sugieren que la inestabilidad observada no surge de procesos de rotura y reparación de doble hebra.
Además, hemos observado que en un mutante rpoS en el que la respuesta general a estrés mediada por RpoS está inactivada, las repeticiones (AC)30 son muy estables aún en condiciones de inducción constitutiva de SOS, sugiriendo que RpoS actuaría como un elemento de regulación superior al sistema SOS en cuanto al mantenimiento de la estabilidad de microsatélites.
En conjunto, los datos obtenidos sugieren un posible mecanismo de actuación de las DNA Pols TLS relacionado con procesos de reparación o reinicio de horquillas de replicación bloqueadas, en el que existiría una competición y una jerarquía en el acceso de estas DNA polimerasas, siendo la inestabilidad causada por eventos de tipo deslizamiento de hebra.
Capítulo 2. Estudio del papel de componentes del replisoma de Escherichia coli en la inestabilidad de microsatélites Hemos analizado el papel de los componentes del replisoma de E. coli DnaB, DnaN y DnaE en la inestabilidad de repeticiones (AC) mediante el uso de los mutantes termosensibles dnaBts, dnaNts y dnaEts. El mutante dnaEts muestra un fuerte aumento de la inestabilidad, un incremento moderado en el mutante dnaNts y no se detectamos un aumento significativo en el mutante dnaBts. Estos datos sugieren que el tipo de estructura de la horquilla de replicación bloqueada a temperatura restrictiva es fundamental para la generación de inestabilidad de repeticiones (AC). Además, el análisis de la región repetida mediante electroforesis bidimensional en geles de agarosa muestra una relación entre los bloqueos de replicación generados en el mutante dnaEts y el incremento en la inestabilidad de las repeticiones (AC)30.
Capítulo 3. Bases fisiológicas de la inestabilidad de microsatélites en el genoma de Escherichia coli Hemos observado que las repeticiones (AC)30 son, sin embargo, estables en células procedentes de crecimiento en cultivo líquido aún bajo inducción constitutiva de SOS. Estos resultados nos llevaron a estudiar las condiciones fisiológicas en las que se genera la inestabilidad de las repeticiones (AC)30. Hemos analizado el efecto de diferentes situaciones de estrés, como cambios de temperatura, paradas de crecimiento o bloqueos en la replicación por tratamiento con hidroxiurea, en la frecuencia de mutación de las repeticiones (AC)30.
Capítulo 4. Análisis genético de uup en la replicación cromosómica Dado que el objetivo general de esta Tesis es el estudio de las bases genéticas de la inestabilidad de repeticiones en el DNA, se plantea el análisis del papel de uup en dicha inestabilidad. El gen uup codifica para una proteína ABC-ATPasa no convencional presente tanto en genomas procariotas como eucariotas. Uup tiene capacidad de unirse al DNA de forma inespecífica y el mutante uup de E. coli exhibe una alta frecuencia de escisión precisa de transposones Tn10 y Tn5. Estos datos sugieren que Uup podría participar manteniendo la estabilidad genética e inhibiendo errores de replicación de tipo deslizamiento de hebra.
En cuanto al mecanismo de acción de Uup, hemos planteado la hipótesis de que Uup podría tener un papel fundamental, bien en la replicación del DNA, bien en el reinicio de horquillas de replicación bloqueadas. Para ello, hemos analizado contextos genéticos en los que la mutación uup confiera una pérdida de viabilidad. Utilizando ensayos de segregación hemos identificado que priA es una mutación sintética letal con uup. La proteína PriA está implicada en el reinicio de horquillas de replicación bloqueadas debido a su capacidad de reconocimiento y unión de estructuras de DNA con forma de horquilla y que media en el reclutamiento de una cascada de proteínas (PriB/PriC, DnaT y DnaC) que permiten finalmente cargar la helicasa DnaB y posteriormente el replisoma completo para reiniciar la replicación. En cambio, las combinaciones uup priA dnaC809, uup recA, uup rep y uup recBCD son viables. Los resultados obtenidos sugieren una participación de Uup en la replicación del DNA, de tal forma que en el mutante uup se produciría un aumento del bloqueo de horquillas de replicación, lo cual haría necesario reiniciar la replicación más frecuentemente que en un contexto silvestre, requiriendo por lo tanto la proteína PriA.
