Producción y caracterización del biopolímero levan para diferentes aplicaciones biomédicas
- Autores: Álvaro González Garcinuño
- Directores de la Tesis: Eva María Martín del Valle (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Salamanca ( España ) en 2019
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Mario Díaz Fernández (presid.), Antonio Monzón Bescós (secret.), Julio San Román del Barrio (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ciencia y Tecnología Químicas por la Universidad de Salamanca
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: GREDOS
- Resumen
La biotecnología ha supuesto una revolución científica en los últimos años, siendo considerada una de las herramientas más potentes para el siglo XXI. La biotecnología busca utilizar microorganismos o partes de ellos para generar productos que sean de gran utilidad para los seres humanos. En esta tesis doctoral se presentan diferentes estrategias biotecnológicas para la producción de un polímero basado en residuos de fructosa, conocido como levan, así como potenciales aplicaciones del mismo en el campo de la biomedicina.
Entre los diferentes productos biotecnológicos, requieren especial atención los biopolímeros, producidos por microorganismos poseen características especiales, que los distinguen de los tradicionales polímeros inorgánicos, como su biocompatibilidad o biodegradabilidad, y los hacen muy adecuados para usos diferentes, en medicina o en alimentación. Los polímeros tradicionales, basados en hexosas, como el alginato o el quitosano, han sido muy usados para diferentes fines, y actualmente se buscan alternativas, con otros polímeros que sean capaces de mejorar algunas propiedades, ofreciendo mejores resultados en el mercado. Entre estos nuevos polímeros destaca el levan porque es capaz de auto-organizarse en agua, formando nanopartículas estables y de pequeño tamaño, y porque es fácilmente modificable, es decir, pueden realizarse transformaciones químicas superficiales que mejoren su biodisponibilidad o su especificidad.
Este polímero ha sido producido tradicionalmente desde bacterias, donde las especies Zymomonas mobilis y Bacillus subtilis han sido las más utilizadas. Las bacterias producen el polímero desde la sacarosa, utilizando una enzima llamada levan-sacarasa, que es capaz de hidrolizar el disacárido y polimerizar la fructosa para formar el polímero. A pesar de conocerse la estructura cristalina de esta enzima, no se había realizado ningún estudio pormenorizado analizando las diferentes secuencias entre los microorganismos que la tienen presente en su proteoma, y estudiando las posibles regiones consenso, así como posibles péptidos señal. Por esta razón, esta tesis doctoral aborda un estudio bioinformático de esta enzima, comparando más de 100 secuencias diferentes, donde se pudo identificar el péptido-señal que es responsable de la secreción de esta enzima al exterior celular (espacio periplásmico o pared de péptidoglicano), así como varias regiones consenso, que contienen aminoácidos fundamentales para la catálisis. Del alineamiento múltiple de secuencias se pudieron establecer relaciones filogenéticas, y agrupar a las bacterias productoras en ocho familias, dependiendo de la homología de sus secuencias proteicas.
A pesar de haberse obtenido en varios trabajos este polímero, nunca se ha caracterizado de forma completa, ni se ha estudiado su cinética de producción. Por esta razón, se tomaron dos especies que presentaban la enzima, pero que no habían sido estudiadas en la bibliografía previamente para la producción de levan: Bacillus atrophaeus como ejemplo de Bacteria Gram positiva, y Acinetobacter nectaris como ejemplo de Bacteria Gram negativa. Mediante el cultivo líquido de estas bacterias se estudió su crecimiento, así como la producción del polímero asociada, determinando las cinéticas de crecimiento microbiano y de producción de levan, así como los valores estequiométricos de la reacción para ambos casos. Los resultados demostraron que se ajusta a una cinética de inhibición por sustrato y por intermediario (glucosa), y la producción de polímero sigue un modelo de Leudeking-Piret, donde la síntesis del polímero va acoplada al crecimiento microbiano.
El polímero obtenido fue caracterizado a nivel físico-químico para certificar la naturaleza del mismo, y se procedió a la preparación de nanopartículas desde éste gracias a su reorganización en agua. Se obtuvieron nanopartículas de 130 nm de diámetro, con carga superficial próxima a 0 mV, pero permanecían estables durante al menos los primeros 15 días después de ser reorganizadas. De igual forma, se observó su forma y distribución al microscopio electrónico, y se estudió el proceso de auto-ensamblado, analizando el entorno hidrofóbico mediante espectrofotometría de fluorescencia, pudiéndose determinar la Concentración de agregación crítica, que quedó fijada en 0.07 mg/mL. Además de lo anterior, se comprobó su baja capacidad para retener proteínas de forma no-específica, lo que supone una ventaja para no ser atrapadas por el sistema inmunitario.
Finalmente, con el objetivo de reducir costes en la producción del polímero, se estudió la posibilidad de usar residuos de la industria alimentaria como fuente de nitrógeno para el crecimiento de estos microorganismos. Esta estrategia resultó adecuada para el crecimiento de B. atrophaeus, consiguiéndose una reducción del 10% en el coste del medio de cultivo.
Estos resultados, con el polímero obtenido de la forma tradicional, fueron comparados con una forma alternativa, basada en la síntesis exclusivamente a partir de la enzima (purificada desde B. subtilis). Se estudió el efecto de numerosos factores en la producción del polímero, tales como la concentración de sustrato, la concentración de intermediarios o de otros azúcares, la temperatura, la proporción enzima-sustrato, la presencia de elicitores como ATP o manganeso, o incluso, la posibilidad de utilizar sustratos alternativos como la rafinosa. De cada una de estas alternativas se pudo estudiar la evolución en la concentración de nanopartículas durante la síntesis, así como su tamaño; observándose diferencias significativas que podrían ser utilizadas para conseguir nanopartículas “a la carta”.
El polímero obtenido también fue caracterizado por las técnicas descritas anteriormente (para el caso de la obtención microbiana), observándose diferencias en las partículas obtenidas, con respecto a la producción tradicional. Por ejemplo, se observan partículas más pequeñas, de tamaño medio 90 nm, con semejante carga superficial y estabilidad, pero una concentración de agregación crítica muy superior (0.20 mg/mL). De igual forma, se observa un peso molecular inferior para este tipo de producción, así como una menor adsorción no-específica de proteínas. Los procesos de síntesis y auto-ensamblado con el sistema enzimático fueron modelados utilizando ecuaciones diferenciales y la proposición de un modelo que englobara ambos fenómenos. Para la determinación de los parámetros se realizó una estimación hessiana, obteniendo, con elevada significación estadística, los principales valores que se encargan de gobernar el proceso. Con esos valores es posible ejecutar simulaciones bajo diferentes condiciones experimentales, que permiten predecir el comportamiento del sistema, así como optimizar para mejorar producción de polímero y ensamblado de partículas.
A pesar de las ventajas que ofrece el trabajo con sistemas enzimáticos en lugar de microbianos, esta posibilidad no es completamente explotada debido a que la purificación de la enzima supone un elevado coste, que reduce considerablemente la viabilidad económica del proceso. Por esta razón, se estudiaron dos alternativas para la inmovilización de la enzima levan-sacarasa, de tal forma que pueda ser reutilizada para varios ciclos de reacción. Concretamente, se trabajó la inmovilización en un reactor de lecho fijo con esferas de alginato, donde la enzima es retenida dentro de las mismas, y en un reactor monolítico, donde la enzima es unida al soporte por un brazo espaciador que contiene un cobre terminal que retiene las enzimas por sus histidinas superficiales.
En primer lugar, se cuantificó la capacidad de retención de la enzima en ambos soportes, alcanzándose valores de 80% para el caso de las esferas de alginato y del 95% para el reactor monolítico. Posteriormente se estudió el efecto de la inmovilización en la reacción enzimática, cuantificando los rendimientos de producción, así como las condiciones de operación de los reactores (caudal, porosidad, longitud del lecho, etc.). Los resultados mostraron que era necesario un elevado tiempo de residencia en el reactor para conseguir que se realizara el intercambio de moléculas entre las fases (líquido-sólido), por lo que los caudales de trabajo deberían ser muy bajos. De igual modo, se demostró que, a esos flujos másicos, el fenómeno de la pérdida de carga puede considerarse despreciable. Las nanopartículas obtenidas desde el polímero producido por este sistema también fueron caracterizadas, observándose diferencias importantes: el tamaño de las producidas desde el lecho fijo se sitúa en 230 nm, mientras que desde el reactor monolítico se mantienen en 150 nm.
Con todos los valores, se formuló un modelo de transferencia de materia, que explicase las diferencias entre los reactores homogéneos y heterogéneos mediante correlaciones experimentales y números adimensionales. Estos resultados muestran que el reactor monolítico presenta una menor resistencia al transporte de materia (0.031 s-1) que el reactor de lecho fijo empaquetado (0.301 s-1).
Dado que la inmovilización debe aportar una reducción de costes, se estudió la viabilidad tecnológica y económica de plantas de producción del polímero utilizando ambas estrategias. Los resultados muestran, que, en ambos casos, el coste de producción es semejante (6000€/kg), y muy inferior al coste que supondría la producción desde un reactor enzimático homogéneo.
Para finalizar la tesis doctoral, se presentan tres potenciales aplicaciones de este polímero, para intentar solventar algunos de los retos de la biomedicina en los próximos años: tratamiento de tumores, control de infecciones bacterianas, prevención de infecciones en prótesis.
Para el tratamiento de tumores, las nanopartículas obtenidas por vía enzimática y vía microbiana fueron usadas como vehículos para transportar un fármaco quimioterápico (5-fluorouracilo) y estudiar su liberación controlada en células tumorales de colon. Las nanopartículas presentaban una capacidad de carga del 0.65%, y los ensayos in vitro demostraron la eficiencia de este tratamiento.
Para el caso del control de infecciones bacterianas, se diseñó un gel basado en alginato que contenía nanopartículas de plata y polímero levan. Estas nanopartículas son capaces de ser liberadas de forma controlada sobre la superficie con infección bacteriana, y detener el crecimiento de las bacterias. Se estudiaron diferentes dosis y con diferentes microrganismos, consiguiendo reducir la supervivencia hasta un 20% en algunos de los casos, en las primeras 24 horas. Con los datos obtenidos se formuló un modelo global que evaluaba la difusión de las partículas en el gel, su liberación, así como la supervivencia de los organismos que vivían fuera de él.
Para la prevención de infecciones en prótesis, se utilizó el polímero levan como recubrimiento para impedir la bioadhesión de patógenos en prótesis de titanio-aluminio-vanadio. El recubrimiento se caracterizó por análisis química, por microscopía y por difracción de Rayos X. La eficiencia de dicho recubrimiento se evaluó al ser expuesto a cultivos de la cepa Staphylococcus, y posteriormente cultivadas en agar sangre, haciendo una cuantificación de las colonias producidas. Los resultados obtenidos muestran un recubrimiento prácticamente uniforme, con una distribución cristalina del polímero. Los resultados microbiológicos muestran que no existe crecimiento de colonias en las prótesis recubiertas mientras que sí existe en el caso de los controles. Estos resultados sugieren una vía de profundización para conseguir prótesis más biocompatibles y que eviten el rechazo o la infección en los pacientes.
