Resumen de Widening the possibilities of liquid chromatography through the use of secondary equilibria with additives and hydrophilic interaction chromatography
La cromatografía líquida en fase inversa (RPLC), cuyo mecanismo de separación se basa principalmente en la polaridad de los solutos, es el modo de cromatografía líquida más habitual en los laboratorios analíticos, debido a su amplia aplicabilidad, fiabilidad, robustez y sensibilidad. Sin embargo, los compuestos ionizados, que son altamente polares, muestran poca o ninguna retención con las fases móviles convencionales formadas exclusivamente por agua y disolvente orgánico. Además, existen graves problemas (largos tiempos de retención, y picos anchos y asimétricos) en el análisis de los compuestos catiónicos básicos, debido a su interacción con los grupos silanol residuales aniónicos presentes en las fases estacionarias de base sílice (que son las más frecuentes). Estos problemas dificultan una aplicabilidad universal de este modo cromatográfico. Una posible solución es el uso de aditivos de diferente naturaleza para inducir equilibrios secundarios.
Con el fin de incrementar el intervalo de polaridades de los compuestos analizados en RPLC y mejorar los perfiles de pico, durante el transcurso de la Tesis Doctoral, se han realizado diversas investigaciones en las que se han utilizado diversos surfactantes y líquidos iónicos como aditivos de la fase móvil, así como una modalidad cromatográfica (la cromatografía líquida de interacción hidrofílica, HILIC), que permite la separación de compuestos de elevada polaridad.
Los estudios realizados han implicado un gran esfuerzo experimental, diseñado para explorar y extraer información sobre el comportamiento cromatográfico de compuestos de diferente naturaleza (sulfonamidas, β- bloqueantes, antidepresivos tricíclicos, flavonas, diuréticos y nucleósidos). Se ha estudiado el uso de surfactantes de diferente carácter como modificadores de la fase móvil: aniónico (dodecilsulfato de sodio, SDS) y neutro (polioxetilen(23)lauriléter (conocido como Brij-35), polioxetilen(10) lauriléter, polioxetilen(10)trideciléter, Brij-L4, Triton X-100, Triton X-114, IGEPAL CO 360 y Span 20), además de los líquidos iónicos cloruro de 1-hexil-3 metilimidazolio (HMIM·Cl) y tetrafluoro-borato de 1 hexil-3-metilimidazolio (HMIM·BF4). Por último, se ha examinado el efecto de cuatro tampones de distinta naturaleza (acetato, formiato, citrato y fosfato), en presencia y ausencia de un líquido iónico, sobre el comportamiento cromatográfico.
A lo largo de todo el trabajo, se han inspeccionado una gran diversidad de condiciones experimentales, utilizando fases móviles acuo-orgánicas con acetonitrilo, fases móviles micelares puras (conteniendo tan sólo un surfactante) e híbridas (conteniendo un surfactante y disolvente orgánico), fases móviles micelares mixtas (conteniendo dos surfactantes), y fases móviles que contienen un líquido iónico, en algunos casos en ambos modos isocrático y de gradiente. El trabajo ha supuesto el uso de una gran variedad de columnas: C18 y C8 en RPLC, y de diverso tipo (sílice, neutra, catiónica, aniónica y zwiteriónica, incluyendo tres columnas de reciente comercialización) en HILIC.
Debe destacarse el gran esfuerzo bibliográfico realizado sobre los diferentes temas investigados. Ello ha implicado la búsqueda, lectura y organización de una gran cantidad de información valiosa, que se refleja adecuadamente en cada apartado de la Tesis Doctoral.
Los capítulos de la Memoria del trabajo realizado incluyen estudios fundamentales sobre el comportamiento cromatográfíco observado en RPLC con fases móviles de surfactantes y líquidos iónicos, y en HILIC con fases móviles de agua-acetonitrilo, así como el desarrollo de métodos para el análisis de preparados farmacéuticos y fluidos fisiológicos, acompañados de una extensa validación. A continuación se detallan ambos tipos de estudios.
1. Estudios fundamentales Los estudios fundamentales tienen el propósito de comparar el comportamiento cromatográfico de diferentes grupos de analitos de diversa polaridad, carácter ácido-base y carga, examinando la retención y la forma de los picos obtenidos en los cromatogramas. En algunos estudios, se han ajustado modelos matemáticos que permiten predecir la retención de los solutos. Por otro lado, se han trazado gráficos que describen la variación de la anchura y asimetría de los picos cromatográficos (los denominados gráficos de semianchura, que revelan la cinética de interacción de los solutos con la fase estacionaria), y la correlación entre los tiempos de retención en distintas condiciones (que indican diferencias en la selectividad alcanzada con distintas columnas o condiciones experimentales). Estos gráficos permiten analizar la calidad de las condiciones experimentales ensayadas, en términos de tiempo de análisis, forma de los picos y resolución. En los estudios realizados, se muestran los cromatogramas de mezclas de los analitos correspondientes a las condiciones óptimas de resolución.
Los estudios fundamentales englobados dentro de la Tesis Doctoral, que se describen a continuación, pertenecen a tres campos de interés:
1.1. Cromatografía líquida micelar (CLM) A pesar de la variedad de columnas disponibles en el mercado, su química todavía es limitada. Sin embargo, mediante la adición de reactivos a la fase móvil, el intervalo de selectividades de las columnas comerciales utilizadas en RPLC puede incrementarse, mejorando su rendimiento en el análisis de una mayor variedad de compuestos químicos. Se realizaron varios estudios que profundizaron en el conocimiento de los factores que producen el ensanchamiento y distorsión de las señales cromatográficas en RPLC, y se desarrollaron estrategias para mejorar el perfil de los picos cromatográficos y su resolución. Se amplió, asimismo, el intervalo de polaridades de los compuestos analizados.
Los aditivos investigados fueron el surfactante SDS y varios surfactantes no iónicos, añadidos a la fase móvil por encima de su concentración micelar crítica. En estas condiciones, los surfactantes se adsorben sobre la fase estacionaria modificando su naturaleza y su exceso permanece en la fase móvil influyendo en su fuerza eluyente. El interés se centró principalmente en el uso del surfactante no iónico Brij-35. Este surfactante es considerado en CLM como una alternativa al surfactante aniónico SDS, ampliamente utilizado en este modo cromatográfico. Sin embargo, a pesar de la relevancia del Brij-35 en las relaciones cuantitativas estructura-actividad (QSAR), su uso es muy limitado. A lo largo de la Tesis Doctoral, se ha realizado un estudio detallado del campo de aplicación del Brij-35 en cromatografía líquida y de las condiciones más adecuadas para realizar los análisis en los modos isocrático y de gradiente. Se examinó también la posibilidad de utilizar otros surfactantes no iónicos y las ventajas del uso de fases móviles mixtas de Brij-35 y SDS.
En primer lugar, se estudió la posibilidad de utilizar fases móviles puramente micelares del surfactante no iónico Brij-35 (es decir, fases constituidas por agua y jabón), en RPLC. La metodología desarrollada puede considerarse como un método de análisis “verde”, que permite minimizar la contaminación y los residuos, aumentando así la sostenibilidad.
La presencia de Brij-35 en la fase móvil ofrece una selectividad particular, que afecta a la retención global de los analitos. Se comprobó que las fases móviles puramente micelares de Brij-35 son adecuadas para la separación cromatográfica de compuestos de polaridad alta o intermedia, o compuestos polares que interactúan con el grupo terminal hidroxilo de la cadena etoxilada del surfactante no iónico por formación de enlaces de hidrógeno. Este último comportamiento se observó con varios flavonoides y sulfonamidas, que contienen grupos hidroxilo y amino, respectivamente. Por contra, se demostró que la polaridad de los β bloqueantes ensayados y la formación de enlaces de hidrógeno internos entre los grupos hidroxilo y amino adyacentes, en estos compuestos, no permiten una interacción suficientemente intensa con la fase estacionaria modificada con Brij 35, por lo que no resultan suficientemente retenidos. Sin embargo, aunque fue posible eluir los flavonoides y las sulfonamidas con fases móviles puramente micelares de Brij 35, el uso de fases móviles híbridas conteniendo una baja concentración de Brij-35 y acetonitrilo mejoró significativamente el rendimiento cromatográfico (los picos fueron más estrechos y los tiempos de análisis más bajos).
Los picos cromatográficos obtenidos para flavonoides y sulfonamidas con Brij-35, en elución isocrática, presentaron una elevada simetría, revelando los gráficos de semianchura diferentes cinéticas de interacción con la fase estacionaria modificada por el surfactante. Para los flavonoides, la cinética de interacción depende de la posición de los sustituyentes hidroxilo en los anillos de benceno de estos compuestos. Por otro lado, utilizando elución en gradiente, la anchura de los picos se redujo significativamente cuando se utilizó una concentración fija de Brij-35 y una concentración creciente de acetonitrilo, o una concentración creciente de ambos Brij 35 y acetonitrilo. La anchura de pico también se redujo a alta temperatura (50 oC), lo que permitió mejorar la resolución de los cromatogramas.
Se comprobó que el uso de gradientes de acetonitrilo, utilizando una concentración fija de Brij-35, es especialmente interesante para el análisis de fármacos en fluidos fisiológicos, permitiendo la inyección directa de la muestra en el cromatógrafo. Se comprobó que puede ser conveniente iniciar el análisis utilizando un medio puramente micelar de Brij-35, y una vez que las proteínas de la muestra han sido eluidas, aplicar un gradiente de acetonitrilo para incrementar la fuerza eluyente.
Dadas las ventajas que puede ofrecer el uso de surfactantes no iónicos como modificadores de la fase móvil en cromatografía líquida y la escasez de referencias sobre otros surfactantes no iónicos en CLM, distintos del Brij-35, se consideró interesante realizar un amplio estudio sobre las posibilidades de surfactantes no iónicos alternativos, en este modo cromatográfico. Dichos surfactantes deberían poseer prestaciones similares a las del Brij-35, e incluso, mejorar significativamente su comportamiento cromatográfico.
El estudio mostró que el polioxietileno(10)tridecil éter (C13E10) y el polioxietileno(10)lauril éter (C12E10) pueden ser utilizados en CLM, debido a su alta solubilidad en agua y nula absorción UV en el intervalo de detección habitual. La solubilidad de otros surfactantes no iónicos fue demasiado baja (Brij L4, TritonX-114 o Span 20), o su absorción UV demasiado elevada (Triton X 100 e IGEPAL CO-630). Se examinaron las propiedades cromatográficas de las fases móviles de C12E10 y C13E10, comparándolas con las obtenidas con el Brij-35. El estudio mostró que la fuerza eluyente de las fases móviles de los tres surfactantes es lo suficientemente intensa para eluir sulfonamidas, β bloqueantes y antidepresivos tricíclicos (TCAs), sin la necesidad de añadir un disolvente orgánico. También es posible analizar mezclas de flavonoides, pero para estos compuestos fue necesario añadir una cantidad relativamente pequeña de acetonitrilo a las fases móviles micelares, con el fin de disminuir los tiempos de retención a valores prácticos.
Los β-bloqueantes y los TCAs (compuestos básicos que muestran carga positiva al pH de la fase móvil) se retuvieron principalmente de acuerdo a su polaridad. Esto se evidenció por la alta correlación entre el coeficiente de reparto octanol agua (log Po/w) y los valores logarítmicos de las constantes de asociación (KAS y KAM), que miden las interacciones de los solutos con la fase estacionaria y la fase móvil, respectivamente. También se comprobó la mayor intensidad de las interacciones de las sulfonamidas analizadas con las fases estacionaria y móvil, que se traduce en tiempos de retención mayores en comparación a los compuestos básicos, lo que puede ser debido a la interacción del grupo sulfonamida con la cadena etoxilada de los surfactantes no iónicos.
Por otro lado, los picos cromatográficos obtenidos con fases móviles de C12E10 y C13E10 fueron más estrechos y simétricos, en comparación con los obtenidos con Brij-35. En el caso de los flavonoides, para los que se necesitó la adición de una pequeña cantidad de acetonitrilo para ser eluidos en tiempos prácticos, los picos fueron más anchos y asimétricos. El estudio indicó que el comportamiento cromatográfico de los compuestos analizados en presencia de C12E10 y C13E10 es similar y depende de la naturaleza del soluto. Sin embargo, entre los tres surfactantes no iónicos (Brij 35, C12E10 y C13E10), sólo el C13E10 aparentemente no se adsorbe irreversiblemente sobre la fase estacionaria, siendo esta característica muy interesante para la conservación de las prestaciones de las columnas.
Una ventaja común de los tres surfactantes es que su adsorción sobre la fase estacionaria incrementa su polaridad, con la consiguiente disminución de los tiempos de retención, para la mayoría de los solutos, evitando en muchos casos la necesidad de un disolvente orgánico y haciendo así la técnica más sostenible medioambientalmente. Sin embargo, a pesar del incremento de polaridad de la fase estacionaria neutra modificada con los surfactantes no iónicos ensayados, que permite analizar compuestos de polaridad baja o intermedia, para aquellos compuestos polares que no pueden establecer interacciones específicas con el Brij-35 la retención es muy baja, o incluso nula. Éste es el caso de la mayoría de β-bloqueantes. Además, con Brij-35, las eficacias son más pobres que con SDS.
Por otro lado, los tiempos de retención de los compuestos básicos, analizados con las fases móviles micelares del surfactante aniónico SDS, son demasiado elevados para ser prácticos, lo que obliga a la adición de una elevada cantidad de disolvente orgánico. La alta retención obtenida es debida a la interacción electrostática de los compuestos protonados (catiónicos) con el surfactante aniónico adsorbido sobre la fase estacionaria. Se consideró así que el uso de una fase móvil mixta que contuviera simultáneamente SDS y Brij-35 podría resolver todas estas limitaciones. Puesto que la fase móvil se prepara con agua, en ausencia de disolvente orgánico, se trata de un método “verde”, que permitiría el análisis de compuestos básicos de diversa polaridad.
En este estudio se comprobó que, efectivamente, para los compuestos básicos (como los β-bloqueantes y TCAs), la capacidad de retención de la fase estacionaria modificada con la fase móvil mixta es mayor en comparación con una fase estacionaria modificada exclusivamente con Brij-35, y significativamente inferior a la conseguida con una fase estacionaria modificada exclusivamente con SDS. Se verificó que las interacciones entre los solutos básicos y las micelas de Brij-35 y la fase estacionaria modificada (medida por las constantes de asociación KAS y KAM) son diferentes a las interacciones establecidas con el sistema mixto Brij-35/SDS, y por consiguiente, también se observaron diferencias en la selectividad. Por otro lado, los picos fueron prácticamente simétricos, similares a los obtenidos con fases móviles que contienen tan sólo el surfactante SDS (en este caso, en presencia de una pequeña cantidad de disolvente orgánico). Esto indica que el efecto del SDS en la fase móvil mixta sobre los grupos silanol de la columna se conserva, lo que dificulta el acceso de los compuestos básicos a los grupos silanol de la fase estacionaria, dando lugar a una cinética de interacción con los solutos suficientemente rápida.
El estudio mostró que la retención de compuestos básicos polares y moderadamente polares (como es el caso del grupo de los β-bloqueantes analizados), demasiado baja cuando se utilizan fases móviles que contienen sólo Brij-35, se puede modular a valores prácticos mediante la adición de SDS a la fase móvil que contiene Brij-35. El sistema micelar mixto dio lugar a una buena resolución y tiempos de análisis adecuados. Sin embargo, para los TCAs, es preferible el uso de fases móviles que contienen únicamente Brij-35.
1.2. Líquidos iónicos como aditivos de la fase móvil en cromatografía líquida En la última década, el interés por el uso de líquidos iónicos como aditivos en RPLC se ha incrementado. La mayoría de las investigaciones que utilizan líquidos iónicos se refieren a la separación de compuestos básicos, intentando eliminar el problema de los silanoles residuales de las columnas convencionales de base sílice y mejorando así el rendimiento cromatográfico. Las interacciones de los líquidos iónicos con los analitos pueden ser más complejas que las observadas con los surfactantes, ya que tanto el catión como el anión en el líquido iónico pueden adsorberse sobre la fase estacionaria. Por otro lado, los tampones añadidos a la fase móvil también pueden afectar al rendimiento cromatográfico. De ahí que se investigara el efecto de tampones de diverso tipo añadidos a la fase móvil, en presencia y ausencia de un líquido iónico, para lo que se seleccionó al HMIM·Cl. La elección de este aditivo para realizar el estudio se debe a que la adsorción del catión (HMIM+) en las columnas C18 es muy significativa, mientras que el anión cloruro no posee apenas afinidad por esta fase estacionaria.
Se evaluó la variación en la retención y la forma de los picos de seis β bloqueantes, eluidos con fases móviles que contenían cuatro sistemas tampón de distinta naturaleza (ácido acético/acetato, ácido cítrico/dihidrógenocitrato, ácido fórmico/formiato y ácido fosfórico/dihidrógenofosfato), a concentraciones crecientes a pH 3, en presencia y ausencia del líquido iónico. Los sistemas tampón polipróticos se estudiaron también a pH 7. Se comprobó que la retención se incrementa mediante la adición de una mayor concentración de todos los sistemas tampón ensayados, tanto en ausencia como en presencia de HMIM·Cl, lo que indica la importancia de controlar la concentración de tampón en los procedimientos analíticos cromatográficos.
En ausencia de líquido iónico, la(s) especie(s) aniónica(s) de los tampones se adsorben directamente sobre las cadenas alquílicas de la fase estacionaria. La especie aniónica del tampón adsorbido sobre la fase estacionaria atrae a los compuestos básicos catiónicos, originando una mayor retención al aumentar la concentración del tampón. La tendencia observada en la retención indicó un inicio de saturación para la concentración de tampón más elevada. Mientras tanto, en presencia del líquido iónico, los aniones de los tampones deben ser atraídos a la fase estacionaria por el catión del líquido iónico. Este comportamiento se evidencia por la tendencia lineal observada para la retención de los compuestos catiónicos: al aumentar la concentración del anión del tampón crece la intensidad de la interacción establecida con la fase estacionaria (y por consiguiente, con los solutos básicos catiónicos), debido a la atracción electrostática hacia la fase estacionaria recubierta por HMIM+.
Los cambios en la retención al añadir el ion HMIM+ fueron significativamente mayores, en comparación a los observados al incrementar la concentración de los tampones. Sin embargo, se observó una elevada correlación entre los factores de retención en presencia y ausencia del líquido iónico, y para concentraciones variables de los tampones. Este comportamiento, así como el mantenimiento del orden de elución de la mezcla de β-bloqueantes en presencia de los distintos sistemas tampón ensayados, sugiere una selectividad similar, lo que se puede explicar principalmente por la similitud de la naturaleza de las interacciones (de tipo electrostático) que se establecen con HMIM+ y/o los aniones de los tampones adsorbidos sobre la fase estacionaria.
Tal como se ha comentado, en ausencia de aditivo, se obtuvieron picos asimétricos debido a la interacción de los compuestos básicos catiónicos con los grupos silanoles libres, especialmente a pH 7. La obtención de picos estrechos y prácticamente simétricos, en presencia de HMIM·Cl a cualquier concentración de tampón, indica una eficaz protección de la columna por parte del líquido iónico, que recubre la superficie de la fase estacionaria C18. En ausencia del líquido iónico, el acceso a los grupos silanol se obstaculiza más eficazmente al aumentar la concentración del tampón, pero el efecto es menor que el observado con HMIM+. De hecho, en presencia de este aditivo, no hay un cambio aparente en la anchura y simetría de los picos, al variar la concentración de los tampones.
Por último, debe indicarse que el ion citrato parece poseer una mayor afinidad por la fase estacionaria, debido a los mayores tiempos de retención y mejores simetrías de pico. En el caso del tampón fosfato, la retención fue algo menor que para los tampones de acetato y formiato, cuyo efecto sobre la retención fue similar. Aunque a pH 3 las especies predominantes, en la fase móvil, para los sistemas de acetato y formiato no son las formas básicas (aniónicas), el aumento en la retención de los β-bloqueantes al incrementarse la concentración de estos tampones sugiere una desprotonación inducida de los sistemas monopróticos, debido a la adsorción de los aniones sobre la fase estacionaria.
1.3. Cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC).
La cromatografía líquida de interacción hidrofílica permite el análisis cromatográfico de compuestos altamente polares. Inicialmente, se utilizaron columnas de fase normal para este modo cromatográfico. Sin embargo, en los últimos años, se han desarrollado nuevas fases estacionarias para obtener un rendimiento adecuado para una variedad de compuestos. HILIC es un campo de rápido crecimiento a lo largo de las últimas dos décadas. El tipo de interacciones que se establecen en este modo cromatográfico es similar a las obtenidas con columnas modificadas con surfactantes y líquidos iónicos. Por ello, se consideró interesante estudiar las características de los picos cromatográficos en este modo cromatográfico, desde una perspectiva similar a la utilizada en los apartados anteriores.
En la investigación realizada, se compararon las propiedades cromatográficas de siete columnas HILIC de distinta naturaleza, disponibles comercialmente, en términos de retención, selectividad, forma de pico y resolución, utilizando como compuestos de prueba un grupo de nucleósidos (adenosina, citidina, guanosina, xantosina, timidina, y uridina) y uracilo. Con este propósito, se hizo uso del mismo protocolo utilizado para las columnas de RPLC modificadas con aditivos. El comportamiento observado reveló información sobre las interacciones establecidas entre los solutos y las fases estacionarias.
Para realizar los estudios, se verificó el acondicionamiento y la regeneración de las columnas, realizando ciclos de cinco inyecciones consecutivas de citidina cada 60 min, hasta conseguir valores estables de tiempo de retención. Para comprobar la reproducibilidad de las medidas, se inyectó también citidina al principio y al final de cada jornada. Se necesitó un tiempo de equilibrado inicial de al menos 12 horas a un flujo de 1 mL/min para el acondicionamiento, mientras que una vez que la columna había sido acondicionada, sólo fueron necesarios 30 min para cambiar a una fase móvil con mayor contenido de agua.
Para comprender el comportamiento de las columnas HILIC, se tuvo en cuenta el estado de ionización de los nucleósidos. Por un lado, adenosina, citidina, guanosina y xantosina se hallan parcialmente protonadas a pH 3, y por otro, timidina, uracilo y uridina existen principalmente en forma catiónica a pH ácido. Las columnas zwitteriónica, amino, HILIC-N y HILIC-B mostraron una mayor retención para todos los compuestos estudiados, lo que revela un carácter más hidrófilo para estas fases estacionarias, donde la capa acuosa adsorbida debe ser más gruesa. Además, el estudio parece indicar que el efecto de los silanoles sobre los compuestos catiónicos se encuentra enmascarado por la capa acuosa adsorbida en las columnas HILIC. Así, aunque las columnas de sílice y diol poseen un carácter neutro sin capacidad de intercambio iónico, la ionización de los silanoles puede proporcionar silanoles aniónicos libres que incrementarían la retención de las bases protonadas (catiónicas). Sin embargo, no se observó dicho comportamiento, ya que los nucleósidos analizados mostraron tiempos de retención bajos cuando se eluyeron con ambas columnas.
Se observaron comportamientos inesperados en la retención ofrecida por las columnas neutra (HILIC-N) y catiónica (la HILIC-A), comercializadas recientemente por ACE. Así, la retención con la columna HILIC-N fue significativamente mayor a lo esperado para los nucleósidos, lo que indica una elevada polaridad para esta columna, a pesar de su capacidad de intercambio iónico presumiblemente baja. Mientras tanto, a pesar de la alta capacidad de intercambio catiónico, reivindicada por los fabricantes, la columna HILIC A dio lugar a los factores de retención más bajos que otras columnas. Por otro lado, el orden de elución de la mezcla de nucleósidos, especialmente para adenosina y citidina, dependió significativamente de la naturaleza de la columna.
Las alta correlación entre los factores de retención para las columnas de sílice, diol y HILIC-A, por un lado, y las HILIC-B, amino y HILIC-N, por otro, indican una selectividad similar. En cambio, la columna zwitteriónica mostró una selectividad particular, pudiéndose explicar parcialmente por la cantidad significativamente distinta de agua adsorbida sobre las columnas.
En términos generales, los picos cromatográficos fueron simétricos para todas las columnas, incluso al eluir solutos catiónicos. Este comportamiento también indica que la actividad de los silanoles residuales es enmascarada, presumiblemente, por la capa acuosa adsorbida. Sin embargo, los picos fueron algo más anchos para las columnas de sílice y HILIC-A, y algo más asimétricos para las amino (picos con colas), seguidos de las columnas de sílice, zwitteriónica y HILIC N (picos con desviaciones frontales). Los mejores resultados en términos de simetría se obtuvieron para las columnas diol, HILIC-A y HILIC B.
Finalmente, la falta de dispersión de los gráficos de semianchura para todas las columnas HILIC (excepto la zwitteriónica) indicó una cinética de interacción similar para el grupo de nucleósidos en las condiciones estudiadas. La resolución sólo fue satisfactoria con la columna zwitterionica.
También se realizó una investigación detallada, con las siete columnas HILIC, sobre los modelos matemáticos más adecuados para modelizar su comportamiento de retención. Además, se comparó el comportamiento con el observado para dos columnas de RPLC en el análisis de compuestos polares (sulfonamidas y diuréticos). Se estudió la exactitud de siete modelos de retención de diversa complejidad, incluyendo modelos que describen mecanismos de retención mixtos (reparto en la capa rica en agua adsorbida sobre las columnas, junto con interacciones polares y electrostáticas). En general, los datos de HILIC proporcionaron mejores ajustes en comparación con los datos de RPLC, probablemente debido a la menor variación de la retención observada para las columnas de HILIC. La calidad del ajuste aumentó con el número de parámetros del modelo. Así, los modelos de dos y tres parámetros muestran un mejor comportamiento, con errores promedio del 1.0% y 0.7%, respectivamente.
Además del estudio de los modelos de retención, se realizó una investigación sobre la fuerza eluyente. En primer lugar, se observó una fuerte correlación entre los valores del parámetro S (que cuantifica la fuerza de elución de la fase móvil en cada soluto) y la ordenada en el origen del modelo LSS (que cuantifica el nivel de retención del soluto), encontrándose las mejores correlaciones para sílice, diol, HILIC-A en HILIC, y Zorbax y Chromolith en RPLC, lo que indica una menor dispersión en el comportamiento del conjunto de analitos. Sin embargo, la conclusión más destacada es que la correlación es muy similar para todas las columnas. De hecho, el comportamiento similar en la capacidad de elución de las columnas HILIC y RPLC es sorprendente, considerando los diferentes mecanismos de retención.
2. Aplicaciones Además de los trabajos fundamentales descritos, la Tesis Doctoral incluye diversos apartados en los que se comprueba la viabilidad de las modalidades cromatográficas estudiadas para su aplicación al desarrollo de métodos de análisis. Concretamente, se han realizado tres aplicaciones, una de ellas al análisis de fluidos fisiológicos, y las otras dos dirigidas al control de preparados farmacéuticos.
En primer lugar, se desarrolló un método analítico, utilizando gradientes de acetonitrilo y una concentración fija de Brij-35 o de SDS, para analizar sulfonamidas en muestras de orina y leche. El objetivo era diseñar un procedimiento que permitiera la inyección directa de muestras fisiológicas. El comportamiento observado, en este estudio, para las sulfonamidas eluidas con las fases móviles de Brij-35 puede explicarse debido a una combinación de las interacciones establecidas con una fase estacionaria modificada de mayor polaridad, y la formación de puentes de hidrógeno entre los grupos amino de las sulfonamidas y el extremo de la cadena de polioxietileno del surfactante no iónico adsorbido. La mayor polaridad de la fase estacionaria modificada se verificó comparando el comportamiento de retención de la serie homóloga de alquilbencenos en ausencia y presencia de Brij-35.
Los métodos desarrollados para leche y orina que utilizan gradientes de acetonitrilo, en presencia de un surfactante, e inyección directa de las muestras, son muy prácticos, debido a su simplicidad, bajo tiempo de re-equilibrado y la eliminación de cualquier tratamiento previo a la etapa cromatográfica, exceptuando el filtrado y dilución de la muestra. La implementación de gradientes de acetonitrilo en el modo micelar, utilizando SDS, permitió la separación de las sulfonamidas en tiempos de análisis prácticos.
En presencia de Brij-35, el tiempo de análisis disminuyó considerablemente en comparación a la elución isocrática, pero la resolución fue insuficiente. En cambio, el uso de elución en gradiente con acetonitrilo, en presencia de Brij-35, puede ser útil para analizar mezclas simples de sulfonamidas. El análisis de muestras de leche fortificada utilizando gradientes de acetonitrilo, en presencia de SDS o Brij-35, no reveló ninguna interferencia de los componentes endógenos de la matriz. Para facilitar la solubilización de las proteínas, lo que incrementó la protección de la columna, se añadió una etapa isocrática de 2 min previamente a la aplicación del gradiente.
Por su parte, el desarrollo de métodos para el control de fármacos en preparados farmacéuticos, se realizó en el modo isocrático con fases móviles que contenían aditivos. El primer método se aplicó a la determinación de β bloqueantes, utilizando una fase móvil preparada con una mezcla de los surfactantes aniónico SDS y no iónico Brij-35, en ausencia de disolvente orgánico. El segundo método se aplicó a la determinación de antidepresivos tricíclicos. En este caso, la fase móvil se preparó con una mezcla de acetonitrilo-agua en presencia del líquido iónico HMIM·Cl.
En ambos casos, se realizó una validación exhaustiva. Ésta se llevó a cabo siguiendo las recomendaciones de la guía de la Conferencia Internacional de Harmonización (ICH), en la que se recomienda evaluar diversos factores, como son los parámetros de calibración (linealidad), la precisión y exactitud intra- e inter-día, los límites de detección (LODs) y cuantificación (LOQs), la robustez y la recuperación de los analitos. La linealidad se evaluó mediante la obtención de rectas de calibrado y la medida de sus pendientes y ordenadas en el origen, durante tres días no consecutivos y a lo largo de tres semanas distintas. Por su parte, la exactitud (error relativo) y precisión (desviación estándar relativa) intra- e inter-día se investigaron durante tres días no consecutivos, a tres concentraciones distintas de los analitos, dentro del intervalo lineal de las rectas de calibrado, realizando seis réplicas para cada analito. Los LODs y LOQs se determinaron como las concentraciones de los analitos que proporcionaban relaciones señal/ruido 3:1 y 10:1, respectivamente. Por su parte, la robustez se examinó utilizando el método OVAT (one-variable-at-a-time), centrándose en los factores flujo, pH, y concentración de disolvente orgánico y de los aditivos. En cualquier caso, se tuvieron en cuenta las desviaciones estándar relativas (RSD) de los tiempos de retención y de las áreas de los picos.
Por último, para medir la recuperación de los analitos en las muestras, se pesó una cantidad apropiada de cada muestra (varias cápsulas homogeneizadas de los preparados farmacéuticos) y se prepararon disoluciones de aproximadamente 25 µg/mL de cada fármaco por quintuplicado, realizándose finalmente inyecciones duplicadas de las mismas. De acuerdo a la guía ICH, el intervalo aceptable de recuperación se debe encontrar entre el 80 y 120%, como se comprobó para todos los preparados farmacéuticos analizados.
El método desarrollado con las fases móviles mixtas de SDS y Brij-35 permitió la elución de los β bloqueantes atenolol, celiprolol, metoprolol, oxprenolol y propranolol, en tiempos de análisis relativamente cortos, con resultados de similar calidad a un procedimiento que utilizaba fases móviles de SDS 0.15 M y 15% (v/v) de 1-propanol. El método que utiliza fases móviles mixtas de SDS y Brij-35 evita, sin embargo, la necesidad de añadir un disolvente orgánico y permite la obtención de tiempos de análisis más bajos. Además, se obtuvieron picos simétricos y una buena resolución cuando se analizaron mezclas de los β-bloqueantes.
Una de las ventajas del método propuesto con SDS y Brij-35 es que la preparación de la muestra es muy sencilla y sólo requiere su solubilización y filtración antes de la inyección. La validación del método de acuerdo a las directrices de la ICH ofreció buenos resultados para los medicamentos analizados. Todas las rectas de calibrado cumplieron con los requisitos de linealidad, con coeficientes de determinación R2 > 0.9990. Además, las pendientes y las ordenadas en el origen de las rectas de calibrado se mantuvieron estables durante todo el proceso de validación, lo que indicó la gran estabilidad de la columna a lo largo de los estudios realizados, así como una buena capacidad predictora de las concentraciones de los analitos. Se obtuvo una buena exactitud y precisión intra- e inter-días, generalmente por debajo del 2%, y los LODs y LOQs fueron inferiores a 0.14 μg/mL y 0.26 μg/mL, respectivamente. Para finalizar, los ensayos de robustez, considerando el flujo, el pH y las concentraciones de Brij-35 y SDS en la fase móvil, arrojaron valores de RSD para los tiempos de retención, generalmente en el intervalo entre el 1% y 2%, observándose una mayor variabilidad para Brij-35 y para las áreas de pico para todos los factores estudiados.
Por último, se evaluó la viabilidad del uso de fases móviles que contienen los líquidos iónicos de 1-hexil-3 metilimidazolio asociado a los iones cloruro (HMIM·Cl) y tetrafluoroborato (HMIM·BF4), para el análisis de compuestos básicos de carácter hidrofóbico (antidepresivos tricíclicos, TCAs) en preparados farmacéuticos. Estos fármacos se asocian fuertemente a las cadenas alquílicas de las fases estacionarias convencionales, por lo que los tiempos de análisis son muy elevados cuando se utilizan métodos convencionales en RPLC. Además, los TCAs interactúan con los silanoles ionizados residuales presentes en las fases estacionarias convencionales de base sílice, lo que se traduce en una mayor retención, y picos anchos y con colas.
Por ello, se pensó que la adición de un líquido iónico podría mejorar el rendimiento cromatográfico de los TCAs. Efectivamente, ambos líquidos iónicos ensayados (HMIM·Cl y HMIM·BF4) originaron picos estrechos y simétricos para los compuestos básicos, cuando se añadieron a las fases móviles hidro-orgánicas. Sin embargo, se observó un efecto de sobrecarga con la columna C18, en presencia de los aditivos, lo que se interpretó por la acumulación de los TCAs hidrofóbicos en la cabeza de la columna. El efecto fue más acusado con HMIM·BF4, debido a la alta afinidad del anión (tetrafluoroborato) hacia la fase estacionaria, que atrae con mayor intensidad a los analitos catiónicos hacia su superficie, mediante interacciones electrostáticas.
El efecto de sobrecarga se minimizó utilizando una columna C8, en presencia del líquido iónico HMIM·Cl en concentración 10 mM. En estas condiciones, se obtuvieron tiempos de análisis razonables y se mejoró el perfil de los picos cromatográficos, utilizando un contenido de acetonitrilo relativamente bajo en la fase móvil (30% v/v), a pH 3.
La validación del método, realizada siguiendo la guía ICH mostró buenos resultados para todos los analitos. Todas las rectas de calibrado cumplieron con los requisitos de linealidad, con coeficientes de determinación R2 > 0.9964, manteniéndose estables las pendientes y las ordenadas en el origen durante todo el proceso de validación. Además, las precisión intra- e inter-día estuvo por lo general por debajo del 1.0%. Por su parte, la exactitud intra-día se encontró en el intervalo entre el –2.1% y el +2.4%, y la precisión inter-día entre el –3.0% y el +2.3%. Los LODs y los LOQs fueron, por lo general, inferiores a 0.25 μg/mL y 0.09 μg/mL, respectivamente para los distintos analitos.
Por último, los valores de RSD en los estudios de robustez sobre la retención oscilaron entre el 0.4% y 1.6% para el flujo, la concentración de acetonitrilo y el pH, pero el intervalo de variación fue mayor para la concentración de HMIM·Cl (en el intervalo entre el 2.8% y 4.8%). Respecto a las áreas de los picos, la variabilidad fue significativamente menor para la concentración de HMIM·Cl (0.4–0.9%), y similar para los otros parámetros analizados. Debe indicarse que el método desarrollado no permite el cribado de los TCAs, aunque arrojó excelentes resultados para el análisis de preparados farmacéuticos que contienen sólo uno de estos fármacos. Para realizar el análisis, la muestra sólo debe disolverse y filtrarse previamente a su análisis.
