Aumento de la potencia oncolítica del adenovirus mediante estrategias basadas en el proceso de liberación viral

• Autores: Alena Gros Vidal
• Directores de la Tesis: Ramon Alemany Bonastre (dir. tes.), Manuel Cascalló Piqueras (codir. tes.), Montserrat (Corominas Guiu) Corominas (tut. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2009
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Daniel Grinberg Vaisman (presid.), Miguel Chillón Rodríguez (secret.), Rubén Hernández-Alcoceba (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Genética
      • Ingeniería genética
    • Virología
      • Virus respiratorios
  • Ciencias médicas
    • Patología
      • Oncología
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• Resumen

  • Con el objetivo de aumentar la potencia oncolítica del adenovirusl se llevó a cabo una bioselección in vivo en que se inyectó un virus previamente mutagenizado al azar y se realizó un pasaje repetido de este virus en un modelo murino con tumores humanos xenoinjertados y se seleccionó el virus del tumor que había demostrado una mayor respuesta antitumoral. El virus seleccionado, denominado AdT1, presentaba un fenotipo de liberación viral aumentada lo cual aumentaba su citotoxicidad en varias células tumorales así como en fibroblastos asociados a tumor. Además, el virus bioseleccionado demostró una mayor actividad antitumoral comparada con el adenovirus salvaje, validando así el método de bioselección para aislar mutantes con mayor potencia antitumoral. Una vez caracterizado el fenotipo del mutante, se construyó un panel de recombinantes entre el genoma del mutante AdT1 y el genoma del adenovirus salvaje (Ad5) para mapar la mutación responsable del fenotipo de aumento de liberación viral. Posteriormente se secuenció la región más pequeña del genoma capaz de reproducir el fenotipo de aumento de tamaño de calva y se detectó una inserción de una adenina en la posición 445 de la proteína E3/19K. Para confirmar que esta mutación era la responsable del fenotipo, se construyó un virus, el mutante AdE3/19K-445A, que únicamente presentaba esta mutación. En efecto, la inserción de esta mutación fue suficiente para reproducir el aumento de liberación ya observado con el mutante AdT1. La mutación E3/19K-445A generaba una versión truncada de la proteína E3/19K de tal manera que esta proteína perdía su señal de retención en el retículo plasmático y, consecuentemente, pasaba a expresarse en la membrana celular. La construcción de un mutante diferente de AdE3/19K-445A que también perdía la señal de retención en el retículo endoplasmático pero que conservaba la capacidad de aumentar la liberación viral nos permitió concluir que el cambio de localización de la proteína E3/19K a la membrana celular era responsable del fenotipo de aumento de liberación viral, posiblemente debido a que esta proteína podría aumentar la permeabilidad celular y alterar la homeostasis de calcio intracelular. Con estos resultados y varios estudios indicando que la alteración de la homeostasis de calcio y otros iones induce la liberación viral de otros virus desnudos, quisimos estudiar la posibilidad que el verapamilo, un bloqueante de canales de calcio, se pudiese utilizar para aumentar la potencia antitumoral de los adenovirus oncolíticos. Para ello, estudiamos el efecto de esta droga en la liberación y replicación del adenovirus salvaje. En presencia de verapamilo, el adenovirus era liberado más eficientemente y presentaba una citotoxicidad aumentada comparada con el adenovirus salvaje sin disminuir su título, un efecto muy similar al observado con el mutante AdT1. Finalmente, estudiamos el efecto de la inserción de la mutación T1 y de la combinación con verapamilo, dos estrategias para aumentar la liberación viral y la dispersión intratumoral, en el entorno de un adenovirus condicionalmente replicativo, ICOVIR-5. Ambas estrategias demostraron aumentar la potencia antitumoral de ICOVIR-5 sin aumentar su toxicidad debido a que ambas actúan en una etapa tardía de la infección viral, la salida de la progenie viral. Nuestros resultados indican que la velocidad de liberación del adenovirus limita la potencia antitumoral de los adenovirus oncolíticos y proponen dos nuevas estrategias, la inserción de la mutación T1 y la combinación con verapamilo, para aumentar la actividad oncolítica del adenovirus.