Aportación al estudio tecnologico de comprimidos bucodispersables por compresión directa
- Autores: J. E. Aguilar Díaz
- Directores de la Tesis: José María Suñé Negre (dir. tes.), Encarna García Montoya (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2011
- Idioma: español
- Materias:
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- Resumen
Una gran variedad de procesos fisiológicos, metabólicos y de desarrollo presentan una ritmicidad con un periodo de 24 horas. La ritmicidad de estos procesos está regulada por un mecanismo endógeno denominado reloj biológico o circadiano que está presente en la mayoría de los organismos estudiados hasta la fecha (Mas, 2008; McClung, 2008; Harmer, 2009). Algunas características del reloj biológico son, la capacidad de sincronizarse mediante señales externas medioambientales (principalmente señales de luz y de temperatura), de mantener la ritmicidad bajo condiciones medioambientales constantes (Mas, 2008; McClung, 2008; Harmer, 2009). Adicionalmente, y para funcionar como un sistema temporal fiable, el reloj circadiano debe de mantener su funcionamiento de forma relativamente independiente ante cambios en la temperatura. Este mecanismo se denomina compensación térmica y constituye otra característica relevante del sistema circadiano (Roenneberg and Merrow, 1999). Esta propiedad permite al reloj mantener el periodo constante en un rango de temperaturas fisiológicamente permisibles (Mas, 2008). La presencia de los relojes circadianos supone una ventaja adaptativa a los organismos, permitiéndoles anticiparse a los cambios ambientales debidos a la rotación de la tierra sobre su eje (Ouyang et al., 1998; Green et al., 2002; Michael et al., 2003; Dodd et al., 2005). Aunque en los últimos años se han identificado numerosos componentes esenciales del sistema circadiano, los mecanismos moleculares y bioquímicos responsables de generar y mantener la ritmicidad aún no han sido identificados completamente. En la mayoría de los organismos la generación de ritmos circadianos está basada en bucles de retroalimentación negativa, con elementos activadores y elementos represores que se regulan mutuamente (Bell-Pedersen et al., 2005; Wijnen and Young, 2006). Específicamente en Arabidopsis thailana el primer modelo postulado contenía dos factores de transcripción tipo MYB, denominados CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) (Wang and Tobin, 1998) y LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY) (Schaffer et al., 1998) que participarían como componentes negativos y un regulador de respuesta atípico denominado TIMING OF CAB EXPRESION 1 (TOC1) (Strayer et al., 2000; Makino et al., 2002) como componente activador. De esta forma, se generaría un bucle de activación/represión de estos tres componentes que conduciría a la expresión rítmica y antifásica de estos componentes (Alabadi et al., 2001). Modelos computacionales validados experimentalmente han postulado la presencia de al menos dos bucles adicionales que estarían interconectados entre sí (Rand et al., 2004; Locke et al., 2006; Zeilinger et al., 2006). No obstante, este modelo aún no incluye todos los componentes identificados hasta el momento y excluye también la importante regulación post-transcripcional que se ha observado en algunos de estos componentes. En Arabidopsis thaliana, el reloj biológico controla múltiples procesos incluyendo la inhibición de la elongación del hipocotilo durante la des-etiolación y la regulación foto-periódica del inicio de floración (Ouyang et al., 1998; Green et al., 2002; Michael et al., 2003; Dodd et al., 2005). En la regulación de este último proceso, estudios previos han demostrado que la coincidencia de luz y una fase apropiada de expresión controlada por el reloj es esencial para la coordinación temporal de CONSTANS (CO) y la activación de FLOWERING LOCUS T (FT) (Kobayashi and Weigel, 2007; Turck et al., 2008; Jackson, 2009).
Nuestros estudios han puesto de manifiesto que la sobre-expresión de CKB4, una subunidad ß-reguladora de la quinasa de caseína 2 (CK2) produce un aumento en la actividad de la CK2 y afecta el correcto funcionamiento del reloj resultando en un periodo corto en la expresión de genes controlados por el reloj. Adicionalmente se ha demostrado que la estabilidad de la proteína CKB4 esta controlada por el reloj dado lugar a una regulación reciproca. Posteriores estudios han revelado que las plantas sobre-expresantes de CKB4 (CKB4-ox) florecen antes que las plantas silvestres, fundamentalmente en condiciones de día corto (8h de luz y 16h de oscuridad). A nivel molecular, este fenotipo de floración se correlaciona con una fase adelantada en la expresión de CO y en una alta expresión de FT no observada en plantas silvestres. En estudios en los que reducimos la duración total de los ciclos de día/noche (T) a 20 horas, para que se ajusten al periodo endógeno del reloj (¿) en plantas CKB4-ox, vemos que la expresión de CO y FT ya no está alterada, presentando patrones muy similares a los observados en plantas silvestres. De estos estudios concluimos que el periodo corto de las plantas CKB4-ox es el responsable del cambio en la relación de fase con el medio externo de la expresión de genes controlados por el reloj, provocando muy probablemente los fenotipos de floración. El análisis de la expresión de otros genes de floración (FKF1, GI), de un gen controlado por el reloj no relacionado con la floración (CAB2) y componentes del oscilador central (CCA1 y TOC1) muestran igualmente un desplazamiento en su fase de expresión que puede ser corregido cuando se ajustan los ciclos T con respecto a ¿. Estudios sobre la inhibición de la longitud del hipocotilo durante la des-etiolación han mostrado que este proceso controlado por el reloj también está alterado en las plantas CKB4-ox, que presentan una longitud de hipocotilo significativamente más corta que la observada en plantas silvestres.
Los fenotipos observados en las plantas CKB4-ox (Perales et al., 2006; Portoles and Mas, 2007)han resultado ser muy similares a los que se habían descrito previamente para las plantas doble mutantes cca1 / lhy (Mizoguchi et al., 2002). Además, otros estudios habían mostrado que las plantas sobre-expresantes de CCA1 (CCA1-ox) presentaban un retraso muy importante en el tiempo de floración y un hipocotilo claramente más largo que las plantas silvestres (Wang and Tobin, 1998). Para estudiar la interacción genética entre CCA1 y la CKB4, generamos plantas doble sobre-expresantes de CCA1 y CKB4 (CCA1-ox / CKB4-ox). Estudios de tiempo de floración y de longitud del hipocotilo han revelado que la sobre-expresión de la CKB4 reduce significativamente la severidad de los fenotipos de las plantas CCA1-ox. Adicionalmente se ha estudiado el efecto de esta interacción genética sobre la regulación de la expresión de TOC1 a lo largo del ciclo circadiano. Tal y como se había descrito previamente (Alabadi et al., 2001; Perales and Mas, 2007), la sobre-expresión de CCA1 causa una importante inhibición de la trascripción de TOC1. Contrariamente, las plantas CKB4-ox presentan una expresión adelantada y una mayor amplitud de TOC1. El análisis de las plantas CCA1-ox / CKB4-ox mostró una expresión de TOC1 muy similar a la que presentan las plantas silvestres. En conjunto, estos resultados indican que existe una relación inversa entre CCA1 y CKB4 a nivel de regulación de la floración, hipocotilo y expresión de TOC1. Estas conclusiones fueron corroboradas en estudios en los que analizamos los fenotipos debidos a la reducción de la actividad CK2. Se esperaba que estos fenotipos fueran contrapuestos a los observados al aumentar la actividad CK2 debida a la sobre-expresion de CKB4 (Portoles and Mas, 2007). Para realizar estos análisis se han utilizado dos aproximaciones diferentes. Por un lado, se han usado dos inhibidores específicos de la actividad CK2: 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) y 2-dimethylamino-4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzimidazole (DMAT)(Bretner et al., 2008). Por otro lado, se han utilizado plantas que expresan un dominante negativo de una subunidad alfa de CK2 bajo un promotor inducible por dexametasona (CKA3-) (Moreno-Romero et al., 2008). En ambos casos se han observado resultados similares, con un retraso de la fase y una reducción de la amplitud de la expresión de TOC1. Estos fenotipos circadianos se ven incrementados en plantas sobre-expresantes de CCA1. En conjunto, estos resultados sugieren que la actividad CK2 pudiera ser antagonista de la función de CCA1 en la regulación de la expresión de TOC1.
Ensayos de doble híbrido previos habían mostrado que CCA1 podría estar interaccionando con CKB3, otra subunidad beta de CK2. Mediante ensayos de co-imunoprecipitación en plantas doble-expresantes CCA1-ox / CKB4-ox hemos determinado la presencia de CKB4 en los immuno-complejos de CCA1. Asimismo, al utilizar un anticuerpo específico de serinas fosforiladas hemos encontrado un incremento del estado de fosforilación de CCA1, debido a la sobre-expresión de CKB4. Estos resultados fueron confirmados mediante geles bi-dimensionales seguidos de análisis tipo Western-blot para detectar CCA1. Nuestros resultados confirmaron un aumento de isoformas con menor punto isoeléctrico en las plantas que sobre-expresan CKB4. Por otro lado, se han realizado experimentos de Complementación Bi-molecular de Fluorescencia (BiFC) para determinar la localización subcelular de la interacción. Las plantas doble sobre-expresantes de CKB4 fusionada a un fragmento de la YFP y CCA1 fusionada al otro fragmento, han mostrado que la interacción ocurre en el núcleo en un patrón puntual no difuso.
Comúnmente la fosforilación de las proteínas produce una serie de cambios en sus propiedades físico-químicas. Uno de los cambios mas habituales es a nivel de la estabilidad proteica. Cuando analizamos los niveles de proteína de CCA1 con o sin la sobre-expresión de CKB4, no observamos cambios significativos, concluyendo que la fosforilación por CK2 no estaría regulando la estabilidad de la proteína CCA1. Otra posibilidad es que CK2 podría estar modificando la actividad funcional de CCA1. Dado que CCA1 es un factor de transcripción MYB hemos analizado mediante ensayos de immuno-precipitación de cromatina (ChIP) la unión de CCA1 a promotores de genes regulados por el reloj. CCA1 ha estado descrito como activador de genes con un máximo de expresión durante las primeras horas de luz y como represor de aquellos genes con máximo de expresión en la transición día noche. Por ello, hemos seleccionado dos genes activados por CCA1 tales como PSEUDO RESPONSE REGULATOR 7 (PRR7) y PSEUDO RESPONSE REGULATOR 9 (PRR9) y dos genes reprimidos por CCA1 como TOC1 y LUX ARRHYTHMO (LUX). Mediante experimentos de ChIP hemos demostrado que CCA1 es capaz de unirse in vivo a los promotores de PRR7, PRR9, TOC1 y LUX. Cuando analizamos el efecto de la sobre-expresión de CKB4 observamos una clara reducción en la unión de CCA1 a estos promotores. En claro contraste, cuando aplicamos DRB o inducimos con DEX las plantas CKA3-, observamos que la unión de CCA1 estaba significativamente incrementada. Estos resultados nos permitieron concluir que la actividad CK2 antagoniza la actividad de unión de CCA1 a los promotores de los genes circadianos que regula.
Recientes artículos han descrito la implicación de la CK2 en la compensación de temperatura en Neurospora Crassa (Mehra et al., 2009). La compensación de temperatura es una propiedad intrínseca del reloj. Bioquímicamente las enzimas aumentan su actividad de forma directamente proporcional con el aumento de temperatura, consecuentemente cabría esperar que cuando se aumenta la temperatura, el reloj funcionara más rápidamente. Sin embargo, cambios constantes de temperatura dentro de un rango fisiológico no afectan al periodo del reloj, manteniéndose cercano a las 24h. Dado el alto grado de conservación de la CK2 a lo largo de la evolución, hemos querido determinar como afectan cambios en la actividad CK2 sobre la compensación de temperatura del reloj en Arabidopsis. Mediante la utilización de dos genes regulados por el reloj tales como CAB2 y CCR2 hemos determinado el periodo circadiano bajo cuatro diferentes temperaturas fisiológicas. Los patrones de expresión se compararon en plantas silvestres, plantas tratadas con DRB y en plantas CKB4-ox. Mientras que en las plantas silvestres no se observan grandes cambios en el periodo con la temperatura, las plantas tratadas con DRB y las plantas CKB4-ox presentaban mayor alteración del periodo a altas temperaturas que a bajas temperaturas. De forma que a mayor temperatura las plantas CKB4-ox presentan periodos más cortos, mientras que a mayor temperatura, las plantas tratadas con DRB presentan un periodo más largo. Estos estudios estarían indicando un papel importante de la actividad CK2 en la compensación de temperatura.
Consecuentemente, se ha analizado la conexión molecular entre CK2 y CCA1 bajo diferentes temperaturas. El análisis de la estabilidad, interacción, fosforilación y unión a promotores han demostrado que mientras que la estabilidad y la interacción de las proteínas CKB4 y CCA1 no se ve modificada por la temperatura, cuando se analiza la fosforilación de CCA1 y la unión a promotores, vemos un aumento de la fosforilación de CCA1 y un aumento de la unión a promotores preferencialmente a altas temperaturas. En conjunto, nuestros resultados indican que tanto la actividad CK2 como la función reguladora transcripcional de CCA1 están correlacionadas con la temperatura. Proponemos que el balance entre estas dos actividades constituye un mecanismo importante en la compensación del período circadiano a diferentes temperaturas en Arabidopsis thaliana.
Alabadi D, Oyama T, Yanovsky MJ, Harmon FG, Mas P, Kay SA (2001) Reciprocal regulation between TOC1 and LHY/CCA1 within the Arabidopsis circadian clock. Science 293: 880-883 Bell-Pedersen D, Cassone VM, Earnest DJ, Golden SS, Hardin PE (2005) Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6: 544 Bretner M, Najda-Bernatowicz A, Lebska M, Muszynska G, Kilanowicz A, Sapota A (2008) New inhibitors of protein kinase CK2, analogues of benzimidazole and benzotriazole. Mol Cell Biochem 316: 87-89 Dodd AN, Salathia N, Hall A, Kevei E, Toth R, Nagy F, Hibberd JM, Millar AJ, Webb AA (2005) Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage. Science 309: 630-633 Green RM, Tingay S, Wang ZY, Tobin EM (2002) Circadian rhythms confer a higher level of fitness to Arabidopsis plants. Plant Physiol 129: 576-584 Harmer SL (2009) The Circadian System in Higher Plants. Annu Rev Plant Biol Jackson SD (2009) Plant responses to photoperiod. New Phytol 181: 517-531 Kobayashi Y, Weigel D (2007) Move on up, it's time for change--mobile signals controlling photoperiod-dependent flowering. Genes Dev 21: 2371-2384 Locke JC, Kozma-Bognar L, Gould PD, Feher B, Kevei E, Nagy F, Turner MS, Hall A, Millar AJ (2006) Experimental validation of a predicted feedback loop in the multi-oscillator clock of Arabidopsis thaliana. Mol Syst Biol 2: 59 Makino S, Matsushika A, Kojima M, Yamashino T, Mizuno T (2002) The APRR1/TOC1 quintet implicated in circadian rhythms of Arabidopsis thaliana: I. Characterization with APRR1-overexpressing plants. Plant Cell Physiol 43: 58-69 Mas P (2008) Circadian clock function in Arabidopsis thaliana: time beyond transcription. Trends Cell Biol 18: 273-281 McClung CR (2008) Comes a time. Curr Opin Plant Biol 11: 514-520 Mehra A, Shi M, Baker CL, Colot HV, Loros JJ, Dunlap JC (2009) A role for casein kinase 2 in the mechanism underlying circadian temperature compensation. Cell 137: 749-760 Michael TP, Salome PA, Yu HJ, Spencer TR, Sharp EL, McPeek MA, Alonso JM, Ecker JR, McClung CR (2003) Enhanced fitness conferred by naturally occurring variation in the circadian clock. Science 302: 1049-1053 Mizoguchi T, Wheatley K, Hanzawa Y, Wright L, Mizoguchi M, Song HR, Carre IA, Coupland G (2002) LHY and CCA1 are partially redundant genes required to maintain circadian rhythms in Arabidopsis. Dev Cell 2: 629-641 Moreno-Romero J, Espunya MC, Platara M, Arino J, Martinez MC (2008) A role for protein kinase CK2 in plant development: evidence obtained using a dominant-negative mutant. Plant J 55: 118-130 Ouyang Y, Andersson CR, Kondo T, Golden SS, Johnson CH (1998) Resonating circadian clocks enhance fitness in cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 8660-8664 Perales M, Mas P (2007) A functional link between rhythmic changes in chromatin structure and the Arabidopsis biological clock. Plant Cell 19: 2111-2123 Perales M, Portoles S, Mas P (2006) The proteasome-dependent degradation of CKB4 is regulated by the Arabidopsis biological clock. Plant J 46: 849-860 Portoles S, Mas P (2007) Altered oscillator function affects clock resonance and is responsible for the reduced day-length sensitivity of CKB4 overexpressing plants. Plant J 51: 966-977 Rand DA, Shulgin BV, Salazar D, Millar AJ (2004) Design principles underlying circadian clocks. J R Soc Interface 1: 119-130 Roenneberg T, Merrow M (1999) Circadian systems and metabolism. J Biol Rhythms 14: 449-459 Schaffer R, Ramsay N, Samach A, Corden S, Putterill J, Carre IA, Coupland G (1998) The late elongated hypocotyl mutation of Arabidopsis disrupts circadian rhythms and the photoperiodic control of flowering. Cell 93: 1219-1229 Strayer C, Oyama T, Schultz TF, Raman R, Somers DE, Mas P, Panda S, Kreps JA, Kay SA (2000) Cloning of the Arabidopsis clock gene TOC1, an autoregulatory response regulator homolog. Science 289: 768-771 Turck F, Fornara F, Coupland G (2008) Regulation and identity of florigen: FLOWERING LOCUS T moves center stage. Annu Rev Plant Biol 59: 573-594 Wang ZY, Tobin EM (1998) Constitutive expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) gene disrupts circadian rhythms and suppresses its own expression. Cell 93: 1207-1217 Wijnen H, Young MW (2006) Interplay of circadian clocks and metabolic rhythms. Annu Rev Genet 40: 409-448 Zeilinger MN, Farre EM, Taylor SR, Kay SA, Doyle FJ (2006) A novel computational model of the circadian clock in Arabidopsis that incorporates PRR7 and PRR9. Mol. Syst. Biol. 2: 58
