Resumen de Regulación del tránsito a membrana de cnt2: determinantes estructurales y factores fisiológicos
Los transportadores presentes en la membrana plasmática median tanto la absorción intestinal como la reabsorción y secreción renales de numerosos compuestos, fisiológicos y farmacológicos. De entre esta variedad de compuestos, los nucleósidos participan en multitud de procesos celulares distintos y esenciales para la supervivencia celular. Los nucleósidos fisiológicos son moléculas formadas por una base nitrogenada unida covalentemente a una pentosa mediante enlace N-glucosídico. Esta estructura les confiere propiedades hidrófilas por lo que su paso a través de la membrana plasmática depende de la presencia de transportadores específicos.
Hay dos familias génicas principales de transportadores de nucleósidos: la SLC29, compuesta por los transportadores de tipo equilibrativo (ENT) caracterizados por una baja afinidad pero amplia selectividad de sustrato; y la SLC28, integrada por los de índole concentrativa (CNT), que presentan una mayor afinidad por el sustrato pero una selectividad más restringida. Debido a su presencia en epitelios absortivos y a su especificidad, estos transportadores juegan un papel importante en la regulación de la homeostasis de los nucleósidos naturales, así como en la farmacodinámica y farmacocinética de los derivados nucleosídicos con actividad antineoplásica y antivírica.
La presencia y funcionalidad de los transportadores de nucleósidos en hígado es particularmente relevante, pues este órgano suministra estas biomoléculas a los tejidos que carecen de la vía de síntesis de novo, como enterocitos y macrófagos. La regulación de los transportadores de nucleósidos en la línea celular Fao y en cultivo primario de hepatocito de rata ha sido ampliamente caracterizada por nuestro grupo, en cambio, la regulación en modelo humano ha quedado limitada a la caracterización de la expresión de CNT1 en la línea celular BC2 tras 35 días en cultivo, ya que esta línea celular no presenta actividad CNT2.
La línea celular HHL5 expresa marcadores y un crecimiento en monocapa propios de hepatocito diferenciado y la caracterización de la expresión de transportadores de tipo concentrativo mostró una actividad principal consistente con CNT2, si bien es cierto que en subconfluencia también se detecta actividad de CNT3. En cuanto a los niveles de ARNm, las HHL5 expresan las tres isoformas (CNT1-3). La modulación de las concentraciones extracelulares de sustrato, en este caso adenosina e inosina, es capaz de regular la cantidad de CNT2 presente en la superficie celular, disminuyendo si el sustrato se halla en exceso. Los ensayos de captación de guanosina, mediante CNT2 tras el tratamiento con interferón ¿ revelaron un doble incremento de actividad, el primero a tiempos cortos compatibles con un efecto post-traduccional de relocalización del transportador y otro a tiempos largos que se corresponde con un efecto transcripcional asociado al incremento de la cantidad relativa de ARNm expresado para CNT2, la aplicación clínica de este efecto aparece en los tratamientos combinados en pacientes de hepatitis C con IFN¿ y Ribavirina, en cuyo caso aumenta la captación del antiviral probablemente debido a la relocalización del transportador. CNT2 se ha descrito como un transportador relacionado con el metabolismo energético, en nuestro modelo, este transportador ve regulada su actividad en función de la activación de la vía glucolítica, y a su vez es capaz de modular dicha vía mediante la captación y fosforilación coordinada del sustrato.
Debido a la presencia de RS1 tanto en epitelio absortivo como en hepatocito, y a su implicación en la dinámica de membrana de algunos transportadores tan diversos como SGLT1, OCT2, PepT1 o GLUT1, se decidió estudiar RS1 como posible regulador del tránsito a membrana de los transportadores de nucleósidos, y en el caso de esta memoria en particular, sobre CNT2. La interacción funcional entre RS1 y CNT2 muestra una regulación negativa constitutiva e independiente de especie en los ortólogos analizados.
Existen evidencias de la importancia del extremo amino terminal tanto en el tránsito de transportadores de nucleósidos. La importancia de esta región quedó patente al describirse sendas interacciones proteína-proteína entre este dominio de CNT2 con la aldolasa B y con la grp58. La identificación de las secuencias señal contenidas en esta región podría aportar información sobre la regulación del transportador. El análisis del extremo N terminal de CNT2 ha permitido identificar los residuos de glutamato E25 y E28 cuya sustitución conlleva una pérdida de estabilidad del transportador en la membrana, y el domino de fosforilación por Caseína Quinasa 2, que al generar el mutante S46G el transportador pierde la localización polarizada en el dominio apical. En muchos casos el dominio extracelular, que para CNT2 corresponde al C terminal, contiene señales relacionadas con el tránsito a membrana. Para nuestra proteína de estudio, el análisis detallado del extremo carboxilo terminal puso de manifiesto un posible puente disulfuro entre Cys615 y Cys649, mientras que la Cys478 , un tercer residuo con efectos adicionales a las dos anteriores, parece presentar otro tipo de modificación, presuntamente una palmitoilación.
Los resultados que se presentan en esta tesis profundizan en los extensos mecanismos de regulación del transportador CNT2 por factores extracelulares, así como en la descripción de determinantes estructurales y funcionales que justifican parcialmente su tránsito a membrana.
