Optical biosensing with nanostructured surfaces
- Autores: M. Nasser Darwish
- Directores de la Tesis: Mauricio Moreno Sereno (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2011
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Gonçal Badenes Guía (presid.), Albert Romano Rodríguez (secret.), Fredrik Nikolajeff (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Biosensado óptico mediante superficies nanoestructuradas Introducción El objetivo de la presente investigación es la profundización en el desarrollo de una serie de técnicas de medida, para el estudio de la adsorción específica de biomoléculas procedentes de un flujo. Éste es un problema de central en biología, pues cualquier sustancia llega a los diferentes tejidos a través de fluidos, siendo el flujo sanguíneo sólo un ejemplo. La naturaleza ondulatoria de la luz establece un vínculo entre el micromundo de los procesos en estudio y el mundo macroscópico de los observadores. La óptica integrada resuelve en gran medida el problema tradicional de la alineación de haces, siempre que se haya provisto un modo eficaz de introducir la luz en las guías de onda. Para ello se propone el acoplo difractivo, que es eficaz a lo largo de amplias áreas.
Técnicas empleadas Todas las técnicas estudiadas se clasifican como de Biosensado óptico de campo evanescente, y se basan en el uso de guías de onda planares como medio para poner en interacción la radiación con la materia. Las tres ideas sobre las que se apoyan son: - Bajo las condiciones de estudio las moléculas que se adsorben sobre una superficie puede considerarse que forman una capa homogénea, cuyo índice de refracción se sujeta al modelo dado por la ecuación de De Feijter.
- La energía propagada a través de una guía de ondas no está completamente confinada en su interior, sino que se atenúa exponencialmente con una profundidad de penetración dentro de la cubierta de alrededor de 100nm. La interacción entre la materia adherida y este campo evanescente a lo largo de la profundidad de penetración provoca un cambio en el índice de refracción efectivo (o constante de propagación) de la guía de ondas.
- Mediante el uso de químicas complementarias una superficie puede prepararse para la adsorción específica de biomoléculas. En estas condiciones la monitorización de espesores e índices de capa otorga información sobre concentraciones específicas.
Tres tipos de sensores fueron estudiados. En los acopladores difractivos tipo Grating Coupler (OGCB) y sensores difractivos de plasmón superficial (SPR-G) el índice efectivo de la guía se utiliza pera la obtención de la densidad de masa adsorbida, mientras que en los sistemas de fluorescencia excitada por guía de ondas (WG-F) el campo evanescente activa una serie de marcadores moleculares.
Grating couplers (OGCB): Para la inserción de la luz en la guía de ondas se propone el grabado de redes de difracción sobre su superficie. Cuando un haz incide sobre la superficie nanoestructurada de una guía de ondas éste se difracta hacia el interior de la guía, produciéndose el acoplamiento resonante si coinciden la constante de propagación característica de la guía y la del haz difractado. Existen dos posibilidades para el estudio del índice efectivo a través de las condiciones de acoplo, la interrogación angular, que trabaja con una única longitud de onda y busca los ángulos a los que se produce resonancia, y la interrogación espectral, que mantiene constante el ángulo de incidencia y busca las longitudes de onda de resonancia.
Resonancia de plasmón superficial (SPR): Los plasmones superficiales pueden modelizarse de la misma manera que los modos de una guía dieléctrica, aunque van asociados a vibración de cargas libres y están sometidos a una fuerte atenuación. Para estos sistemas se propone también el acoplo difractivo como vía para conseguir la condición de resonancia.
Fluorescencia excitada por luz guiada: Es posible emplear el campo evanescente para la excitación de marcadores fluorescentes. Así, una guía de ondas pone la energía de excitación directamente en contacto con la muestra, evitando los problemas de atravesar con ella un medio dispersivo o incluso fluorescente. La intensidad de la emisión fluorescente dependerá de la energía suministrada y de la concentración de marcadores activados por la interacción específica.
Diseño Diferentes parámetros fueron optimizados para garantizar la fabricación de sistemas con sensibilidades adecuadas: el espesor de capa, el periodo de la red de difracción, la profundidad de grabado y el ciclo de trabajo de estas redes y finalmente su ubicación en cada sensor.
Modelización de los sistemas en estudio: Los sistemas en estudio no pueden modelizarse únicamente mediante una capa plana, pues van incorporando biocapas moleculares a medida que un experimento tiene lugar, y tampoco la superficie de las redes de difracción es plana. Se propone como herramienta sistemática una combinación entre el método de matriz de transferencia generalizado y el modelo de capa equivalente. Esta propuesta consiste en definir una guía con un número arbitrario de capas, cada una de las cuales se representa por una matriz de transferencia y unos parámetros promedio dependientes de la geometría y configuración de cada uno de sus estratos. Empleando estas herramientas se resuelve numéricamente la ecuación de autovalores para las condiciones de guiado óptico. A partir de este método y de la derivación numérica para la obtención de índices efectivos y sensibilidades se obtuvieron optimizaron diferentes estructuras: Guías dieléctricas: Se propuso como estructura para el guiado de ondas una capa de alto índice de refracción (nitruro de silicio, n = 2.02) sobre óxido de silicio (n = 1.46). Esta combinación fue propuesta por su integrabilidad con la tecnología de fabricación CMOS. Trabajando en medio acuoso y a una longitud de onda de 633nm, se encontró que el espesor óptimo de la capa de guiado es de 65nm, para el que se encuentra una sensibilidad refractiva de 0.15RIU[neff ] / RIU[nc]. Si bien fueron también estudiadas las capas de guiado de polímero (en concreto PMMA), las sensibilidades obtenidas fueron un orden de magnitud inferiores.
Capas metálicas para SPR: Con el fin de aprovechar las posibilidades de nanoestampación de los polímeros se propuso su utilización como sustrato para otro tipo de sistema. Si bien también sería posible el depósito de una capa dieléctrica sobre sustrato polimérico, se prefirió el ensayo de la técnica de acoplo difractivo de plasmón superficial (SPR-G), empleando para ello una capa de oro como guía. En los sensores de este tipo se necesita la creación de un modo antisimétrico de propagación, que se extiende principalmente hacia la cubierta en lugar de hacia el sustrato. Para la aparición de este modo existe un espesor de corte, que para la estructura propuesta es de 50nm. La sensibilidad de este modo se mantiene en torno a 0.9RIU[neff]/RIU[nc], actuando como refractómetro.
Redes de difracción Por eficiencia de acoplo era necesario que las redes de difracción actuasen dentro del primer orden de difracción. Esto implica que el periodo de red debe ser del orden de la longitud empleada. Se decidió emplear un periodo de red de 500nm, con las siguientes consecuencias: - El acoplo de un haz de 635nm en la guía dieléctrica se produce entre 13 y 14 grados.
- En interrogación espectral, las longitudes de onda de acoplo del plasmón superficial están entre 720 y 730nm.
Se estudió además el efecto de la presencia de la red de difracción sobre el índice efectivo, mediante las técnicas descritas al principio. Las conclusiones fundamentales son las siguientes: a) La aproximación de capa delgada, según la cual la presencia del grating puede despreciarse, es un caso límite cuando la profundidad de grabado tiende a cero o cuando el ciclo de trabajo (fracción de cada periodo sin grabar) tiende a la unidad y b) La sensibilidad disminuye a medida que un mayor volumen de muestra penetra en la estructura, de modo que la aproximación de capa delgada conduce a las sensibilidades más elevadas. Esto es así debido a que las capas equivalentes tienen índices de refracción más bajos, lo que disminuye el índice efectivo y la concentración del campo evanescente.
Los resultados teóricos fueron avalados por medidas experimentales realizadas con unos sistemas de prueba fabricados expresamente para este propósito.
Para la ubicación de las redes de difracción se tuvo en cuenta la atenuación en la propagación de los modos en guías dieléctricas, y para su tamaño se estimó su eficiencia de acoplo. A partir de una serie de medidas sobre los sistemas de test se encontró que la atenuación era de alrededor de 7dB / cm, lo que conducía a intensidades perfectamente detectables al cabo de entre 6 y 7mm.
Validez como biosensores El modelo de capa equivalente fue empleado para simular la adsorción de partículas en la superficie de los sensores, a fin de establecer una relación entre su sensibilidad como refractómetros con su respuesta biosensora. Como valores de referencia se propuso 30nm de espesor y 30kDa para el peso molecular de las partículas. Los resultados fueron los siguientes: - Para un OGCB optimizado de nitruro de silicio con una resolución angular de 10¿ 3 grados, se obtienen los límites resolutivos de 8·10 - 5RIU y 4ng / cm2, como refractómetro y biosensor, respectivamente.
- Para un sistema SPR-G funcionando en interrogación espectral y con una resolución de 0.01nm se obtienen sensibilidades de 1.6·10 - 5RIU o 1ng / cm2, respectivamente.
Configuraciones y características Existen dos posibilidades para la exploración de las resonancias de acoplo en el dominio angular, y otra serie de características que fueron implementadas.
Esquema de red de entrada: En este caso, a medida que el sensor se hace rotar, la orientación del haz incidente varía con respecto a la dirección normal. Eventualmente puede alcanzarse un ángulo de incidencia que verifique la condición de acoplo. Si esta exploración se realiza continuamente, el ángulo de resonancia puede monitorizarse en función del tiempo, y así obtener información cinética en tiempo real.
Esquema de red de salida: Si, de algún modo, pudiese mantenerse un haz guiado constantemente, la presencia de una red de difracción sobre la superficie de la guía provocaría el desacoplamiento de este haz, a través de un ángulo dado por una condición de (des)acoplo análoga a la anterior. Este ángulo puede medirse con una cámara, y la no necesidad de explorar mecánicamente el rango de ángulos de resonancia acelera enormemente la tasa de muestreo del sensor. Para mantener la luz dentro de la guía de onda se propone la utilización de otra red de difracción. Esto presenta el problema de mantener las condiciones de acoplo invariables sobre la red de entrada, mientras la red de salida aún actúa como elemento de transducción.
Pasivación: A fin de afrontar esta dificultad se propuso la para los biosensores basados en guías dieléctricas la incorporación de una capa de pasivación, de óxido de silicio, de tal manera que sólo las redes de difracción empleadas para la detección estuviesen expuestas al medio exterior.
Multisensado y autorreferencia: En los sensores de doble red de difracción, se propuso la implementación de hasta un total de 8 parejas de redes (canales), a fin de permitir la medida paralela de las concentraciones de diferentes sustancias que puedan fluir al mismo tiempo sobre el sensor. Adicionalmente, se mantuvo la pasivación sobre alguno de los elementos de desacoplo, lo que permitió la obtención de una medida de desacoplo invariable, con respecto a la cual los demás ángulos pudiesen medirse. Este sistema de referencia en el chip fue complementado con una estrategia de funcionalización y bloqueo selectivo de los canales, que permite distinguir entre la sensibilidad a la adsorción específica y la respuesta sensibilidad al índice de refracción del buffer en el que el analito está disuelto.
Fabricación y test Resumiremos aquí la secuencia de fabricación de los biosensores basados en guía de onda dieléctrica y de los sistemas SPR-G.
Fabricación de Grating Couplers: Partiendo de una oblea de silicio de 4", las etapas de fabricación de estos sensores fueron las siguientes: - Limpieza RCA - Creación de una capa buffer como sustrato, mediante oxidación térmica.
- Depósito de una capa de guiado de nitruro de silicio por fase de vapor a baja presión (LPCVD).
- Definición de las marcas de alineamiento de la oblea por fotolitografía y grabado seco.
- Definición de las redes de difracción por litografía por haz de electrones (e-beam)..
- Grabado iónico (Reactive Ion Etchig) de las redes de difracción.
- Pasivación de toda la oblea: depósito de SiO2 en fase vapor asistido por plasma (PECVD).
- Definición de las ventanas de sensado por fotolitografía, y grabado con HF.
Fabricación de SPR-Gs: A partir de una lámina sustrato de policarbonato adquirida a Goofellow, se propuso el siguiente proceso de fabricación: - Nanoestampación de las redes de difracción.
- Sputtering de 50nm de Au sobre la superficie de las muestras.
- Inspección de los resultados mediante microscopía de fuerzas atómicas, AFM.
Instrumentación y medidas En todos los equipos es necesaria la inyección controlada de muestras, y la estabilización de la temperatura. Se propuso una configuración de inyección mediante bomba peristáltica, y control térmico por celda Peltier, con integración en una celda de flujo específica y control por software. Para proporcionar luz coherente linealmente polarizada se emplearon láseres y elementos ópticos discretos. Se propuso un sistema de fuentes de luz intercambiables mediante un espejo rotatorio para aplicaciones en diferentes longitudes de onda.
Tanto los bloques de instrumentación como las interfaces software fueron diseñadas con el propósito de ser intercambiables entre sí, mejorando la configurabilidad de los sistemas. Para la interrogación angular por ángulo de entrada se programó un sistema motorizado basado en un controlador y un motor de pasos de Newport, mientras que para la interrogación angular por ángulo de salida se programó una interfaz para una cámara Marlin SXGA de 1392x1040 píxeles. En este último caso se implementó un algoritmo de análisis de regiones de interés sobre la imagen que permite su uso para cualquier número de canales.
En el caso de los sistemas de excitación de fluorescencia se empleó un filtro de longitudes de onda en combinación con un fotomultiplicador para medir la intensidad luminosa en la emitida en la dirección normal a la superficie, en la banda de emisión de los marcadores.
Los sensores de plasmón superficial funcionaban con interrogación espectral. La iluminación se realizaba con luz blanca, y las resonancias de acoplo eran detectadas empleando un espectrómetro Ocean Optics, sobre la luz reflejada.
Aplicación Si bien en la mayoría de los casos la viabilidad de los dispositivos como biosensores se evaluó a partir de pruebas de calibración refractométrica, en el caso de los Grating Couplers de doble se presenta un experimento de adhesión específica. En este experimento se tienen en cuenta los ángulos de acoplo de entrada (pasivado), que se mantiene fijo durante el experimento y los de salida a través de una red de difracción funcionalizada y otra bloqueada. Los resultados de este experimento demuestran la capacidad del sistema para detectar concentraciones adorbidas en flujos donde la proteína (Bovin Serum Albumin) está presente en concentraciones picomolares.
Conclusiones Tres técnicas de biosensado óptico con superficies nanoestructuradas han sido presentadas: los acopladores dieléctricos (OGCB), los sensores SPR con acoplo difractivo (SPR-G) y los sensores de fluorescencia excitada por guía de onda (WG-F). En relación a los problemas planteados al principio, este trabajo aporta las siguientes respuestas: - Sería deseable disponer de una herramienta potente y fácil de interpretar para representar todos los sistemas: Se presenta un método de modelización unificado para sensores de guiado óptico con capas nanoestructuradas, capaz de representar efectos de segundo orden y procesos de adhesión de partículas en superficie.
- No siempre la resolución o rango dinámico de una técnica satisface los requisitos de su aplicación: La implementación de sistemas Grating coupler de doble red, interrogados por cámara, además de una elevada sensibilidad, posee un rango dinámico ajustable en función de la distancia entre red de desacoplo y detector.
- La frecuencia de muestreo puede ser insuficiente en función de la cinética de reacción: Si bien un proceso de barrido optimizado fue descrito para los equipos de acoplo resonante por red de entrada, las velocidades de muestreo en los sistemas de doble red y SPR-G mostraron tasas de muestreo notablemente superiores, debido a la supresión de piezas móviles.
- La interpretación de las medidas se apoya a menudo sobre modelos en lugar de sobre evidencias: los equipos OGCB permiten la obtención simultánea de espesor e índice de refracción de las capas depositadas, sin necesidad de hacer suposiciones sobre cómo el proceso tiene lugar. Además, un diseño de sensor e instrumentación que habilita el análisis simultáneo mediante acoplo por red de difracción y excitación de marcadores fluorescentes facilita la realización de pruebas complementarias.
- El coste por muestra es elevado en comparación con otras técnicas: A nivel de aplicación, predomina la necesidad de detección de analito conocido, para el que hay disponibles modelos de depósito fiables. Este es, por ejemplo, el caso clínico. En este contexto los sistemas SPR-G propuestos proporcionan buenos límites de detección y requieren técnicas de fabricación de bajo coste.
- Las muestras se han de preparar por adelantado: La implementación de referencia en chip para sensores basados en guías de onda dieléctricas, combinada con sus características multicanal permite el análisis de muestras heterogéneas.
