Resumen de Identificación de genes diana regulados por el receptor nuclear nor-1 en células vasculares a través de mecanismos de transactivación y de transrepresión
Durante la progresión de la patología aterosclerótica, las células que componen la pared vascular sufren importantes alteraciones en su patrón de expresión génica, confiriéndoles un comportamiento pro-aterogénico. Los factores de transcripción son actores claves en la regulación de la expresión génica, y su identificación y la determinación del papel que tienen en el proceso aterogénico resulta imprescindible para entender la enfermedad.
Recientemente, nuestro grupo identificó al receptor nuclear NOR-1 (Neuron-derived Orphan Receptor-1) como un nuevo factor de transcripción implicado en la cardiopatía isquémica. Como para muchos otros receptores nucleares, se han identificado genes regulados por los miembros de esa familia, tanto a través de un mecanismo ¿clásico¿ de trans-activación (por unión a un elemento de respuesta en el promotor del gen diana), como a través de un mecanismo de trans-represión (independiente de la interacción al ADN). Sin embargo, actualmente se desconocen los genes regulados por NOR-1 directamente implicados en dichos procesos. El objetivo principal del presente proyecto de tesis doctoral fue la identificación de genes regulados por el receptor nuclear NOR-1 en células vasculares, tanto a través de un mecanismo de trans-activación como de trans-represión.
El estudio se basó en la identificación de genes diana de NOR-1 mediante análisis de expresión génica global por microarrays de células musculares lisas vasculares (CMLV) humanas modificadas genéticamente (modelo de sobre-expresión lentiviral) o en las que se bloqueó la inducción de NOR-1 en respuesta a LDL. La estrategia de bloqueo con ARN de interferencia (siRNA) generó una alta frecuencia de falsos positivos provocados por el silenciamiento inespecífico de otros genes (conocidos como ¿off-targets¿). Se decidió optar por el método opuesto y estudiar el efecto de la sobre-expresión de NOR-1, así como de Nurr1 y de Nur77, en CMLV humanas mediante transducción lentiviral. Este método permitió la identificación de tres nuevos genes diana de los receptores NR4A (A2M, VTN y SMPX). El estudio reveló que la regulación de estos genes se realizaba por un mecanismo de transactivación, a través de la unión de estos receptores NR4A a elementos de respuesta presente en sus regiones promotoras. Además, se identificó de un nuevo elemento NBRE no convencional en el promotor de SMPX.
El estudio permitió relacionar los receptores NR4A con el proceso inflamatorio al observar que un gran número de genes implicados en este proceso se encontraban inhibidos en las CMLV que sobre-expresaban estos receptores. Se evaluó el posible papel anti-inflamatorio de NOR-1 in vivo mediante un modelo de ratón transgénico diseñado para expresar la proteína NOR-1 humana en CMLV. El conjunto de datos obtenidos en el modelo animal permitió evidenciar por primera vez el potencial anti-inflamatorio de NOR-1 in vivo. Mediante diferentes técnicas de genómica y proteómica, se identificaron varios mecanismos moleculares susceptibles de explicar un antagonismo de NOR-1 con el factor de transcripción NF-¿B, uno de los principales responsables del establecimiento del estado inflamatorio crónico que caracteriza la patología aterosclerótica.
Durante el estudio, se identificó la quimioquina CCL20 como un gen regulado por LDL en CMLV, y se caracterizó el mecanismo dependiente del factor de transcripción NF-¿B. Se evaluó la importancia de la secreción de CCL20 sobre la migración linfocitaria, y se observó que los niveles de CCL20 eran más altos en lesiones ateroscleróticas, en donde colocalizaba con las CMLV. Asimismo, el secretoma proveniente de ateromas mostró niveles de CCL20 significativamente más altos comparados con los niveles de CCL20 proveniente del secretoma de arterias sanas. También se encontraron niveles de CCL20 circulantes más elevados en pacientes hipercolesterolémicos. Se identificó el LPA como uno de los componentes de las LDL responsables de la inducción de CCL20 en CMLV. La expresión de CCL20 aumentaba al bloquear NOR-1 en células estimuladas con LDL. Por otro lado, al sobre-expresar NOR-1 en CMLV se reducía significativamente la inducción de CCL20 por LDL, lo que reforzó la hipótesis del papel anti-inflamatorio de este receptor nuclear.
De acuerdo con los objetivos planteados, la presente tesis doctoral ha permitido identificar nuevos genes regulados por NOR-1 en células vasculares, tanto a través de un mecanismo de transactivación como de un mecanismo de transrepresión. Además, se involucra a la quimioquina CCL20 en la enfermedad aterosclerótica, se caracteriza su regulación por LDL y se describe por primera vez su posible papel como nuevo biomarcador de enfermedad arteriosclerótica en sujetos hipercolesterolémicos aparentemente sanos.
