Physical aspects of biological regulation from molecular interactions to multicellular dynamics
- Autores: Nico Alexander Geisel
- Directores de la Tesis: Miguel Rubí Capaceti (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2011
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Jordi García-Ojalvo (presid.), Marta Ibañes Miguez (secret.), Richard A. Neher (voc.)
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
Muchos procesos biológicos tienen una función específica, la de alcanzar un propósito o conseguir una meta. Ejemplos son el estado de madurez que alcanza un embrión, con formas y tamaños precisos de los órganos, la respuesta rápida y precisa de un sistema genético a una perturbación, o el crecimiento más rápido posible de una población bacteriana en un cierto entorno. A lo largo de la vida todos los organismos están sujetos a cambios del entorno. Deben responder a diversos estímulos y adaptarse a micro ambientes muy variables. La regulación biológica permite que un organismo pueda coordinar sus estados y su dinámica con los estados de su entorno, con el fin de alcanzar su objetivo. En esta tesis hemos investigado diferentes aspectos de la regulación biológica a nivel de interacciones moleculares para la regulación genética, del crecimiento de poblaciones microbianas en entornos cambiantes, y del desarrollo embrionario en la mosca Drosophila Melanogaster.
Para permitir un mejor seguimiento del trabajo, cada sección de esta tesis termina con un breve resumen y una conclusión y discusión detalladas. Presentamos un breve resumen que creemos útil para los lectores interesados en obtener una idea global del trabajo.
El `¿binding¿¿ cooperativo de múltiples proteínas al ADN juega un papel esencial en la regulación de la transcripción y de otros procesos fundamentales en biología molecular: permite respuestas complejas y no lineales y es el central punto de interés del segundo capítulo de esta tesis. Para la regulación de transcripción, e.g., en respuesta a una perturbación de una célula, frecuentemente las proteínas regulatorias tienen que acoplarse simultáneamente a sitios específicos y adyacentes del ADN, por lo tanto alteran la expresión de los genes y cambian el estado de la célula. Se cree que generalmente las respuestas celulares y genéticas, e.g., a un estímulo ambiental, están bajo una fuerte presión selectiva para alcanzar una respuesta rápida y bien ajustada. Por ello, unas proteínas específicas, llamados factores de transcripción (FTs), deben rápidamente buscar y encontrar sus sitios específicos en el ADN (los operators o targets), ensamblarse con múltiples otros FTs, y unirse a ellos y a los operadores con una afinidad específica. En esta tesis hemos tratado de comprender cómo estos requisitos imponen restricciones sobre las interacciones entre diferentes FTs, y entre los FTs y el ADN. El espacio de parámetros de sistemas de regulación genética en general tiene muchas dimensiones y no es obvio a priori como reducir el problema físico a una forma manejable que todavía permite deducir conclusiones sustanciales y generales. Por lo tanto hemos parametrizado el sistema en términos de energías de interacción de FTs con el ADN, con los operadores, y con otros FTs, y hemos explorado las cinéticas y las estadísticas de equilibrio utilizando métodos de la física estadística y de los procesos estocásticos.
Hemos encontrado que para interacciones débiles entre FTs, el ensamblaje de múltiples FTs en los operadores se produce a través de una vía monomérica en la cual distintos FTs llegan a sus operadores de forma independiente y consecutiva. Por ello FTs individuales posiblemente se disocian del operador al que están adheridos antes de que lleguen los otros FTs. Este efecto que nominamos `¿missed encounters¿¿, determina el tiempo total hasta que todos FTs se hayan ensamblado en la region de operadores y proporciona un límite superior al número de FTs que puedan co-regular un gen simultáneamente. Hemos encontrado que una cooperatividad débil entre los FTs, aparte de modificar el estado de equilibrio, también puede reducir el tiempo de ensamblaje comparado con el caso en el que los FTs no interactuan. Si los FTs interaccionan fuertemente, localizan los operadores adyacentes a través de una vía oligomérica, donde los FTs pre-ensamblan y buscan en conjunto. La interacción entre FTs y el ADN puede ser optimizada para una búsqueda rápida de monómeros o del oligómero, pero no simultáneamente para ambos.
Poniendo nuestros resultados en el contexto de un AND-Gate transcripcional, hemos encontrado una compensación entre la rapidez de respuesta del AND-Gate y del `foldchange` del promotor de salida en el estado estacionario, es decir, la capacidad de un promotor de distinguir si solo uno o dos FTs son activos. Mientras que una alta cooperatividad permite una alta discriminación del promotor entre los escenarios en los cuales una o dos especies de FTs son activos, i.e., permite una mejor función AND en estado estacionario, un aumento en la cooperatividad también esta asociado con un aumento en los tiempos de ensamblaje, y por lor tanto con tiempos de respuesta mas largos. A niveles de cooperatividad intermedia encontramos un régimen con una cinética particularmente lento y se prevé que este régimen se evita por las células. Por lo tanto, se determinaron los regímenes de parámetros en los cuales los FTs y los operadores permiten una respuesta combinatoria. Por último, hemos relacionado nuestros resultados con diversos experimentos biofísicos y bioquímicos. Dentro de un contexto más amplio nuestros resultados muestran que el tiempo medio de respuesta de un promotor aumenta con la complejidad de la función regulatoria implementada (como por ejemplo la función AND).
El tercer y cuarto capítulo se centraron en problemas centrales de organismos unicelulares que viven en entornos cambiantes. Alrededor del 80% de la biomasa bacteriana se encuentra en estados de reposo con una actividad metabólica muy baja, como por ejemplo los estados de quiescence o de dormancy, que permiten a los microbios sobrevivir periodos prolongados de estrés o carestia de nutrientes (starvation). Mientras que las moléculas y las cinéticas de inducción de sistemas de microbial stress-response han sido estudiado intensamente, las consecuencias de reducir la actividad metabólica (downregulation) para la supervivencia y el crecimiento de una población en ambientes cambiantes aún no había sido aclarado. En particular, cuando organismos unicelulares están expuestos a estrés se enfrentan a un problema intrínseco de tradeoff entre aumentar la resistencia al estrés (aumentar su capacidad de sobrevivir) y mantener su capacidad de multiplicarse rápidamente cuando el estrés cesa: en estados de baja actividad metabólica pueden sobrevivir largos periodos de estrés, por el contrario, cuando el ambiente mejora la reactivación requiere un tiempo significativo. Este retraso de reactivación y crecimiento puede ser perjudicial en un entorno competitivo, un hecho que se resume en el primer principio de ecología microbiana "if you are asleep you wont get dinner". Después de miles de millones de años de evolución los microbios han aprendido su lección y adoptaron diferentes comportamientos y estrategias para hacer frente a esta disyuntiva en ambientes alternantes entre estrés y crecimiento. Sin embargo, por qué y bajo qué condiciones ciertos comportamientos proporcionan una situación ventajosa era algo desconocido hasta ahora.
Basado en datos experimentales proporcionamos un primer enfoque sistemático para estudiar la fitness de poblaciones bajo este tradeoff en entornos que alternan entre estrés y crecimiento. Hemos encontrado que este tradeoff determina los regímenes de parametros ambientales en los cuales cuatro comportamientos microbiales comunes proporcionan un beneficio. Así, poblaciones pueden aumentar significativamente su fitness ajustando algunos parámetros que caracterizan su respuesta al estrés, es decir, el momento de downregulation, la intensidad de downregulation, y la variabilidad de esta entre distintas células. Asombrosamente, existen estados celulares de downregulation óptimos (que maximizan la fitness a largo plazo) durante el estrés, pero que no maximizan la fitness momentanea durante los periodos de estrés. Por otro lado, hemos demostrado que los estados de resistencia a estrés muy alta, como por ejemplo dormancy, se convierten en estados óptimos sólo cuando las condiciones ambientales promedios no permiten el crecimiento de la población. Hemos encontrado que en poblaciones heterogéneas, es decir en poblaciones en las cuales distintas células tienen distintos grados de resistencia al estrés, la muerte celular diferencial proporciona un elegante mecanismo de adaptación de población (en contraste a un mecanismo de adaptacion celular) a entornos letales y persistentes. La variabilidad celular, por lo tanto, aparece como una simple estrategia para hacer frente a grandes fluctuaciones ambientales que son típicas en la naturaleza. Estos resultados proporcionan nuevas perspectivas sobre la función de respuestas microbianas a estrés ambiental con nuevos experimentos propuestos para verificar nuestras predicciones.
En el cuarto capítulo hemos investigado estrategias óptimas para la expresión de genes.
Los microbios responden a cambios ambientales ajustando la expresión de genes, así que ciertas proteínas se producen a un nivel que corresponde a la demanda por la proteína. Sin embargo, ajustar las concentraciones de proteínas es un proceso lento. Por consiguiente, puede ocurrir que en un entorno fluctuante las células alcancen la concentración óptima de una proteína (la concentración que maximiza el crecimiento celular) solo después de un tiempo cuando la demanda por la proteína ha cambiado de nuevo, i.e., cuando la concentración óptima es otra. Por ello no está claro a priori si la expresión de genes on-demand (una estrategia adaptiva), es decir producir la proteína solo cuando se necesita, es siempre la estrategia óptima para maximizar el crecimiento en un entorno cambiante. De hecho, muchos genes se expresan de forma constitutiva a niveles intermedios, lo que representa un permanente coste de producción de proteína, pero también proporciona un beneficio inmediato a la célula cuando la proteína es de repente necesaria. ¿Cuáles son las condiciones que seleccionan una estrategia de expresión regulatoria, i.e., on-demand, y cuales seleccionan por una expresión constitutiva? ¿Qué factores determinan el nivel de expresión constitutiva óptimo en un entorno cambiante y cómo esta afectada la fitness de las dos estrategias por el ruido de expressión o la estocasticidad ambiental? A partir de un modelo sencillo probado para la dinámica de expresión de los lac- y gal-operons, se estudió la fitness de ambos estrategias en entornos que cambian temporalmente. De modo sorprendente, se encontró que el nivel de expresión constitutivo óptimo es distinto de la demanda media para la proteína y del nivel de expresión óptimo promedio, dependiendo de cómo la fitness momentaria depende del nivel de expresión de la proteína. Contrario a la intuición hemos encontrado que la expresión constitutiva puede proporcionar una fitness mayor a la expresión regulada (on-demand), aun cuando el mecanismo regulador, e.g., el mecanismo sensorial de la célula, no le cuesta nada a la célula. Se determinó la tasa mínima de una respuesta genética para que una expression regulada (expression-on-demand) pueda conferir un beneficio comparado a la expresión constitutiva. Encontramos que la variabilidad inter-celular puede favorecer la estrategia de expresión regulada, mientras que la variabilidad disminuye la fitness de la estrategia constitutiva. Sorprendentemente, se demostró que una población con estrategia adaptiva puede aumentar su fitness anticipando cambios ambientales, cambiando su estado antes de que cambie el ambiente. Hemos demostrado generalmente que la tasa de crecimiento promedio de una estrategia adaptiva es más grande en un ambiente que cambia aleatoriamente que en un entorno que cambia de forma determinística, y que este resultado es independiente de los detalles del modelo.
Nuestros resultados muestran como la frecuencia de demanda por la expresión de un gen y la tasa de respuesta genética están relacionados con la fitness, y como esto determina las condiciones bajo cuales un gen debería ser regulado o no. Nuestros resultados también revelan preguntas importantes sobre la evolución de la regulación genética. Algunas de nuestras predicciones ya pueden ser comparados con experimentos y concordan con recientes datos de high-throughput. Para otras explicamos cómo promotores parcialmente inducibles y métodos de microfluídica pueden ser utilizado para verificarlas.
En el quinto capítulo se analizó la organización y la dinámica de componentes del citoesqueleto durante la formación del surco ventral en embriones de la mosca D. Melanogaster. En este proceso, el epithelio ventral, con el grueso de una sola célula, se pliega a lo largo de una linea a partir de contracciones apicales y asimétricas de células individuales. Cytoesqueletos contráctiles y proteínas de adhesión juegan papeles centrales en la regulación de la morfogénesis de los órganos y tejidos, pero los mecanismos moleculares subyacantes pueden variar considerablemente de un sistema a otro. Comprender cómo estas moléculas se organizan en el espacio y en el tiempo puede proporcionar profundos conocimientos en cómo la morfogénesis esta coordinada y regulada. Usando métodos de análisis cuantitativa de imagenes se encontró que la acto-miosina y los adherens junctions (AJs) colocalizan fuertemente en puntos discretos dentro de las membranas intercelulares apicales del epitelio ventral. Esto es en contraste con el mecanismo de plegado de la mayoría de los tejidos donde la contracción apical de las células es proporcionado por un cable contráctil circumferencial del ápice celular. Mientras que el tejido se pliega, una tensión orientada en la dirección cabeza-cola (anterior-posterior, AP en contraste a la dirección ventral-lateral, VL) está establecido, mientras que las células individuales contraen principalmente en la dirección VL. Sugerimos que los AJs se reorganizan bajo tensión de una forma que en promedio AJs se localizan preferentemente en la dirección de mayor tensión. En distintas células, sin embargo, las posiciones angulares de los AJs difieren mucho, lo que indica que sus posicionamientos están determinados por el entorno mecánico celular local, en lugar de un posicionamiento celular-autónomo. En células individuales la acto-miosina, en cambio, no tiene ningúna orientacion preferencial, lo que sugiere que las células tienen en promedio una contractilidad isotrópica. La distribución de acto-miosina en las células puede variar fuertemente en el tiempo y de una célula a otra, lo que sugiere que la contracción del tejido es un proceso colectivo que no puede ser explicado por el comportamiento de una sola célula o de la célula media. Al nivel del tejido encontramos que acto-miosina se somete a un cambio estructural al inicio de la invaginación del tejido, donde la acto-miosina cambia de una conformación difusa y fragmentada a una estructura coherente y supracellular. Esta estructura se contrae en la dirección VL, estableciendo al mismo tiempo fibras de acto-miosina orientadas en la dirección AP que se acoblan a los AJs. Esto sugiere que la contracción de la red supracelular de acto-miosina da lugar a las contracciones de células individuales que, por restricciones geométricas como la conservacion del volumen celular, resultan en el plegado del tejido.
En resumen, este trabajo ha abarcado diversos aspectos de la regulación biológica, de los mecanismos moleculares de regulación de los genes, a las estrategias de regulación de las poblaciones microbianas, a la regulación de los cambios morfológicos en el desarrollo embrionario de D. Melanogaster. Se ha descubierto la base de los mecanismos físicos de regulación de la transcripción por múltiples factores de transcripción, presentó modelos analíticamente tratables para cuantificar y comparar estrategias de regulación de poblaciones bacterianas homogéneas y heterogéneas, y aclaró los mecanismos de la remodelación de tejidos en el desarollo embrional en términos de un proceso colectivo autoorganizado. Por lo tanto, pone acento en el papel central de la regulación biológica, visto desde una perspectiva de física teórica.
