Síntesis de compuestos de platino y estudio de su interacción con biomoléculas
- Autores: Esther Escribano Aranda
- Directores de la Tesis: Virtudes Moreno Martínez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2012
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Antonio Laguna Castrillo (presid.), Amparo Caubet Marín (secret.), Joan Jesús Fiol Arbós (voc.)
- Materias:
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- Resumen
La continúa búsqueda de nuevos fármacos quimioterapéuticos derivados del platino que presenten una menor quimioresistencia y una mayor selectividad hacia las células tumorales, junto con la necesidad de comprensión de sus efectos a nivel biológico ha motivado la realización del presente trabajo, en el cual se lleva a cabo la síntesis y el estudio de la interacción de varios compuestos de platino con distintas biomoléculas. Los objetivos y el trabajo se han estructurado de la siguiente manera: *Estudio cualitativo del efecto de los diferentes ligandos X (ligando dicarboxilato) y Am (ligando amínico o diamínico), compuestos tipo [Pt(Am)2X] y tipo [Pt(Am)X], en la interacción con su diana biológica, el DNA.
*Estudio de la interacción de compuestos de Pt(II) con proteínas implicadas en distintos procesos cancerígenos y anticancerígenos.
*Desarrollo de una metodología sintética para la obtención de compuestos de Pt(IV) derivados del picoplatino. Determinación de los potenciales de reducción de los compuestos sintetizados y posterior evaluación de la actividad citotóxica y selectividad de éstos en líneas celulares que sobreexpresan glutatión.
*Síntesis de un compuesto de Pt(IV) conjugado al ácido fólico a través de un espaciador de polietilenglicol. Evaluación de la actividad citotóxica del conjugado en una línea celular que sobreexpresa los receptores de folato.
La metodología sintética descrita por Dhara para la obtención de compuestos [Pt (Am)2X] ha permitido obtener una serie de compuestos con dicarboxilatos como ligandos salientes (X). Todos los compuestos se han caracterizado por las técnicas habituales. En los casos en los que se han obtenido cristales, han resultado adecuados para la difracción de rayos-X, hecho que ha permitido conocer los detalles estructurales de los mismos.
Del estudio de la interacción de los distintos compuestos de Pt(II) con el DNA se destaca que de todos los ligandos aminados, el ligando 1R,2R-trans-diaminociclohexano (dach) es el que presenta una mayor tendencia a compactar las hebras de la doble hélice. Este comportamiento es mucho más acusado en el compuesto [Pt cdbca(dach)]. El mayor carácter aglutinante se atribuye, en este caso, a la lipofilicidad que aportan ambos ligandos al compuesto, los cuales pueden establecer mayores interacciones hidrofóbicas con la biomolécula. El aumento de la compactación se refleja en un menor descenso de los valores de la viscosidad y en una menor movilidad electroforética de las formas CCC. El compuesto [Pt cbdca(dach)] es, de todos los sintetizados, el que presenta el mejor valor de citotoxicidad. Los resultados obtenidos en las medidas de viscosidad revelan que los compuestos en estudio interaccionan de dos formas distintas, la mayoría de ellos interaccionan covalentemente con el DNA, aunque algunos de ellos lo hacen también mediante interacciones débiles no covalentes con la doble cadena. Los ligandos 2-aminoetilpiridina y 4-hidroximetilpiridina facilitan este tipo de interacción. No se observa un incremento en la actividad antitumoral de los compuestos de Pt(II) asociado al aumento del número de eslabones de los quelatos. De esta manera, aún teniendo la capacidad de aumentar el valor del coeficiente de partición, este parámetro parece no ser relevante, al menos en el estudio realizado para esta línea celular en concreto.
Los compuestos [Pt cbdca(temed)] y [Pt mdbs(temed)] no presentan un valor de IC50 bajo en la línea celular utilizada como para resultar atractivos para la síntesis de fármacos dirigidos. No obstante, el compuesto [Pt cbdca(dach)] podría ser eficaz, aunque las etapas de protección y desprotección de las aminas que su síntesis conlleva no podrían evitarse.
El compuesto [Pt bzmal(opea)] es capaz de inhibir la enzima Topoisomersa I. De esta manera, se presenta como un posible agente inhibidor de la proliferación celular e inductor de los procesos apoptóticos. Lamentablemente, estos resultados no se pudieron relacionar con los valores del IC50.
Los estudios de interacción proteína-compuestos tipo [Pt(Am)2X] y tipo [Pt(Am)X] realizados por HPLC-EM e IMMS, demuestran que los tres compuestos seleccionados son capaces de unirse a las proteínas Ubiquitina y PCI. Los aductos más estables formados provienen de las interacciones Ubiquitina-[Pt dcch(4-hmpy)] y PCI-[Pt cbdca(dach)]. Por otro lado, las proteínas en fase gas no experimentan una gran variación conformacional tras su unión con los compuestos en estudio. De esta manera, el PCI podría actuar como vehiculizador de los compuestos de platino y aumentar así la especificidad de los fármacos.
Mediante IMMS y aplicando dos técnicas de fragmentación en fase gas distintas, se ha podido obtener la secuencia de aminoácidos de los fragmentos del aducto Ub-Pt dcch(4-hmpy)2, aducto monofuncional. Considerando los fragmentos que contienen la diferencia de masa correspondiente al platino, se obtiene un fragmento de cuatro aminoácidos, dónde el átomo metálico se encuentra unido al azufre de la Met1. El segundo fragmento, de cadena más larga, sugiere que el átomo de platino pudiera estar unido a la única histidina presente en la proteína. Recientes estudios realizados por MS/MS demuestran que la unión del cisplatino a la Ubiquitina se establece preferentemente en los residuos T12 y T14. Este hecho manifiesta que la distinta naturaleza de los ligandos y de los aductos formados con la proteína condiciona los lugares de unión del platino a la proteína. Por otro lado, es importante destacar la fortaleza de la unión Pt-proteína, que se mantiene después de 72 horas de reacción y tras aplicar un potencial de 100 V. Este hecho podría indicar una unión preferencial Pt-Ubiquitina frente a la unión Pt-DNA, con las consecuencias que ello tendría en los procesos de resistencia adquirida a los tratamientos.
Los estudios realizados por HPLC-EM ponen de manifiesto la capacidad del glutatión para ¿secuestrar¿ la fracción platinada unida a la proteína. Los compuestos ternarios formados entre los aductos Pt-Ubiquitina y GSH parecen actuar como intermedios en la liberación de la fracción platinada de la proteína para devolverla de nuevo al torrente sanguíneo. Esta reacción de sustitución sigue un mecanismo asociativo.
Los tres compuestos en estudio se unen al Citocromo C. La interacción de compuestos de Pt(II) con ligandos salientes dicarboxilatos conduce a la formación de biaductos y triaductos, lo cual implica un mayor grado de metalación de la proteína. Por otra parte, la proteína en fase gas sufre un cambio conformacional destacable tras la unión, evidente para z=8. Este cambio da lugar a un estado conformacional de la proteína más plegado.
Se han sintetizado y caracterizado, por las técnicas habituales, una serie de compuestos de Pt(IV) derivados del picoplatino con grupos carboxilatos de cadena creciente coordinados en posición axial. Se obtuvo el monocristal del compuesto cis,cis,trans-[PtCl2(2-metilpiridina)(NH3)(propanoato)2], lo que permitió conocer sus parámetros estructurales.
Se obtuvo el valor de Ep (potencial de reducción) para cada uno de los cinco compuestos y se observó que éste aumentaba a medida que acrecentaba la longitud de la cadena hidrocarbonada coordinada en posición axial. Se puede concluir que cuanto más lipófilo es el compuesto de Pt(IV), más fácil es su reducción.
El picoplatino y sus análogos se seleccionaron, junto con el cisplatino, para ser ensayados en cuatro líneas celulares de mesotelioma pleural maligno (MPM), en células mesoteliales humanas (HMC) y en la línea celular de cáncer de ovario A2780, usada como referencia por ser sensible al cisplatino. Los resultados mostraron que, en general, cuanto más larga es la cadena hidrocarbonada del carboxilato coordinado en posición axial, más citotóxico es el compuesto de Pt(IV), acercándose e incluso superando en algunos casos, a la actividad mostrada por el cisplatino.
Cuando los compuestos de Pt(IV) estudiados reaccionan con GSH, se observa la formación de las correspondientes especies de Pt(II) (con t1/2 bastante similares entre ellas, entre 25 y 32 minutos), apoyando la hipótesis de que el mecanismo de activación de los compuestos de Pt(IV) se produce a través de su reducción.
Los resultados obtenidos con la línea celular resistente al cisplatino, MM98R, la cual se caracteriza por exhibir altos niveles de glutatión intracelular, especialmente durante el tratamiento con fármacos de platino, indica que el valor del factor de resistencia obtenido para los compuestos t,c,c-[Pt(acetato)2Cl2(2-metilpiridina)(NH3)], c,c,t-[PtCl2(2-metilpiridina)(NH3)(propanoato)2] y t,c,c-[Pt(butanoato)2Cl2(2-metilpiridina) (NH3)], (compuestos de Pt(IV) derivados del picoplatino) podría estar relacionado a una menor inactivación de sus análogos reducidos.
Se ha sintetizado con éxito un compuesto de Pt(IV) derivado del picoplatino al que, a través de un espaciador de polietilenglicol, se le ha unido a una de las posiciones axiales, mediante un enlace amida, el ácido fólico. El compuesto se ha purificado por recristalización y se ha caracterizado por 1H-RMN, HPLC-EM y espectrometría de masas.
Se ha evaluado la actividad antitumoral del conjugado picoplatino-folato en la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231, la cual sobreexpresa los receptores de folato. Los resultados obtenidos no han mostrado una citotoxicidad elevada. Este hecho se podría atribuir, entre otros factores, a la permanencia del conjugado en el interior de las vesículas ácidas, que siguen al proceso de invaginación por endocitosis, disminuyendo de esta forma, su actividad citotóxica.
