Mecnismes de refresssio de la nefropatia diabetica induits per hgf
- Autores: María Flaquer Rifé
- Directores de la Tesis: Josep Maria Cruzado Garrit (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2012
- Idioma: español
- Materias:
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- Resumen
INTRODUCCIÓN. La insuficiencia renal cronica (IRC) se define como la pérdida progresiva, generalmente irreversible, de la función renal. El origen de la IRC puede ser debido a diversos motivos que ocasionan la pérdida de masa renal. La nefropatia diabética es, actualmente, la principal causa de IRC, sobretodo en países desarrollados, pues se ha convertido en una enfermedad pandémica que continúa en fase de crecimiento. El tratamiento de una lesión considerada "incurable" como es el caso de la nefropatía diabética avanzada implica regresión de las lesiones de esclerosis glomerular e intersticial. Actualmente, la única medida terapéutica que se conoce para el tratamiento de la IRC terminal es el tratamiento sustitutivo renal: procedimientos de diálisis (diálisis peritoneal y hemodiálisis) y trasplante renal. Aunque existan diferentes estrategias de renoprotección, hay una escasa evidencia clínica en la regresión de las lesiones de la IRC.
Hepatocyte growth factor (HGF) es un factor de crecimiento multifactorial involucrado en procesos de apoptosis, fibrosis, inflamación y angiogénesis. En estudios previos realizados en nuestro grupo, se demostró que la terapia génica con HGF humano induce regresión de la nefropatía diabética avanzada en ratas. Así, HGF induce una disminución de factores pro-fibróticos y el aumento de la acción de metaloproteasas que, juntamente con su acción proliferativa y antiapoptótica, podría explicar su efecto local. Además, estudios recientes realizados en modelos de daño hepático sugieren que HGF actuaría como movilizador y/o localizador de células madre de la médula ósea hacia el órgano diana, donde estas células ejercerían su acción reparadora.
HIPÓTESIS. La hipótesis de este trabajo es que HGF ejercería regresión de la nefropatía diabética avanzada mediante, además de una acción directa sobre las células residentes, gracias a que sería capaz de movilizar y dirigir las células madre de la médula ósea (HSCs y/o MSCs) hacia las zonas de esclerosis (principalmente glomerular) donde ejercería su papel reparador.
OBJETIVOS. Los objetivos a alcanzar en este trabajo son: 1. Construir un modelo animal diabético (db/db) y quimérico, con las células de médula ósea expresando enhanced green fluorescent protein (EGFP), sin modificar el curso normal de la nefropatía diabética.
2. Verificar en el nuevo modelo animal quimérico db/db - EGFP+ los experimentos previos realizados en nuestro grupo con terapia génica con HGF, en diferentes modelos de daño renal.
3. Analizar si HGF tiene un efecto en el tropismo de las células de médula ósea hacia el órgano dañado.
4. Estudiar si las células derivadas de médula ósea tienen la capacidad de integrarse en la estructura del riñón.
MÉTODOS. Para alcanzar el primer objetivo se realizó trasplante de médula ósea (TMO) en ratones db/db que sufren una mutación en el receptor de la leptina, Diabetes Mellitus de tipo 2, obesidad y resistencia a la insulina, y donde el donante es un ratón C57BL6 transgénico para EGFP. El TMO idóneo para crear un animal db/db - EGFP+ consiste en una previa irradiación (en ratones db/db de 24 semanas de edad) de 10.5Gy y una dosis de células de médula ósea infundidas de 7.5millones/animal. De esta manera, los ratones db/db continuaban siendo diabéticos, puesto que el TMO realizado a esta edad (cuando la nefropatía diabética está establecida) no modificaba el curso normal de la nefropatía diabética.
Los tres siguientes objetivos se alcanzaron realizando terapia génica con HGF en los ratones db/db - EGFP+. Se realizaron diferentes grupos de tratamiento: a) db/db - TMO. Ratones db/db expuestos a TMO.
b) db/db + HGF. Ratones db/db expuestos a TMO y con tratamiento con terapia génica con HGF c) db/db + G-CSF. Ratones db/db expuestos a TMO y con tratamiento con mobilizador de células de médula ósea.
d) db/db + HGF + G-CSF. Ratones db/db expuestos a TMO y con tratamiento con terapia génica con HGF y mobilizador G-CSF.
e) db/-. Ratones control heterocigotos (sanos, no diabéticos).
f) db/db. Ratones db/db sin TMO ni tratamientos.
RESULTADOS. Los resultados obtenidos con estos tratamientos fueron los siguientes: - HGF y parámetros funcionales: todos los grupos tratados con HGF, ya sea en monoterapia o en combinación con G-CSF, se mantuvieron hiperglicémicos, de igual manera que el grupo tratado con G-CSF. De manera que ni HGF ni G-CSF tuvieron ningún efecto sobre la hiperglicemia. Los niveles de albuminuria disminuyeron de manera significativa en los grupos tratados con HGF: el grupo db/db+HGF mostró una disminución significativa respecto al grupo db/db-TMO, de la misma manera lo hizo el grupo db/db+G-CSF, pero se observó una disminución aún más importante cuando la terapia génica con HGF se combinaba con la administración de G-CSF.
- HGF y glomeruloesclerosis: Sólo la terapia génica con HGF (ya sea en monoterapia o en combinación con G-CSF) estaba asociada a una disminución significativa de colágeno IV. Además, los grupos tratados con HGF (db/db+HGF y db/db+HGF+G-CSF) mostraron una disminución en la acumulación de fibronectina. De manera contraria, la administración de G-CSF, aunque produjo una disminución en la albuminuria, no hizo ningún efecto en la reducción de la glomeruloesclerosis en los ratones db/db.
- HGF y factores de crecimiento: La terapia génica con HGF, en monoterapia o en combinación con G-CSF, produjo una reducción en la ratio TGFß/HGF, cosa que no sucedió cuando se administró G-CSF en monoterapia. De la misma manera, observamos que los grupos tratados con HGF disminuía los niveles de CTGF y, además, el grupo tratado con GCSF también provocaba esta disminución. Observamos, pues, que la terapia génica con HGF estaba asociada a una disminución de la transcripción de genes profibróticos.
-m HGF y mobilización de HSCs: No se observó movilización de HSCs cuando los animales recibieron HGF (db/db+HGF). La adición de G-CSF a estos animales fue capaz de incrementar de manera significativa las HSCs circulante. Este resultado sugiere que HGF no tiene ningún efecto movilizador de HSCs a sangre periférica, sino que el efecto viene dado por la administración de G-CSF.
- HGF y SDF-1: Observamos que la terapia génica con HGF estaba asociada a un incremento en la expresión de SDF-1 en tejido renal. Este efecto era aún más evidente cuando se combinaba con la administración de G-CSF (db/db+HGF+G-CSF), a pesar de que estos dos grupos no eran diferentes de manera significativa.
- HGF y reclutamiento de células EGFP+: la movilización de células de médula ósea con la administración de G-CSF dio lugar a un incremento de fluorescencia EGFP en el riñón. También la administración de HGF aumentaba la cantidad de fluorescencia EGFP. De manera consecuente, la combinación de HGF con la movilización de HSCs con G-CSF incrementó de manera más evidente la cantidad de células derivadas de médula ósea en el riñón diabético, mostrando diferencias significativas con respecto al resto de grupos. Estas células EGFP+ se observan en el córtex renal (especialmente en el glomérulo) y también en la médula, de manera que, posiblemente, se dirigen allí para inducir reparación.
- HGF y reclutamiento de macrófagos: La mayor parte de células EGFP+ localizadas en el riñón expresaban el marcador de macrófago F4/80. Por otra parte, también se observaron algunos macrófagos que no expresaban EGFP. Principalmente, los macrófagos se localizaban alrededor de los glomérulos y en el intersticio. Casi todos los macrófagos eran positivos para EGFP, lo que significa que eran macrófagos derivados de la médula ósea. Además, se observó también que casi la mitad (43.7%) de los macrófagos (F4/80+) observados en el grupo tratado con HGF y G-CSF eran de tipo regenerativo (M2). El grupo tratado con HGF presentaba un 60% de macrófagos M2 y en el grupo tratado con G-CSF era de un 33.9%.
- HGF y células glomerulares: No observamos ninguna célula mesangial ni endotelial ni ningún podocito que expresara EGFP. En cambio, observamos un número muy reducido, menor del 0.5%, de células epiteliales de la cápsula de Bowman que expresaba también EGFP. Este hecho sólo se producía en ratones que habían recibido HGF, ya sea en monoterapia o en combinación con G-CSF.
DISCUSIÓN. Los resultados de los dos trabajos presentados muestran, por una parte, la posibilidad de crear un modelo animal diabético y quimérico con las células de médula ósea expresando EGFP mediante TMO y, por otra parte, evaluar con este nuevo modelo animal db/db - EGFP de qué manera están involucradas las células derivadas de médula ósea en el proceso de reparación renal inducido por HGF.
En este trabajo, lo primero que se observó fue la presencia de células EGFP+, derivadas de la médula ósea, en el riñón diabético, alrededor de los glomérulos y en la papila. Se observó que el número de estas células aumentaba en los ratones tratados con HGF y también en los tratados con G-CSF. Para analizar a qué linaje celular pertenecían estas células EGFP+ observadas, se realizó immunofluorescencia con los marcadores de MSCs CD90, CD73, CD105. No se observó ninguna célula EGFP+ que coexpresara alguno de estos marcadores mesenquimales mencionados, sugieriendo que las células EGFP+ observadas pertenecían al otro linaje celular de la médula ósea: HSCs.
Se conoce bien que G-CSF moviliza las HSCs desde la médula ósea hasta la sangre periférica, pero no se conoce bien cual es el papel de HGF sobre estas células. Frente al posible papel movilizador de las HSCs que podría tener HGF, se analizó por citometría de flujo la proporción de HSCs, con fenotipo Sca1+, cKit+, Lin-, que había en sangre periférica en los diferentes grupos de tratamiento. Así, después de tratar los animales con G-CSF se observó, tal y como se esperaba, un aumento significativo en el número de HSCs en sangre periférica. En cambio, no se observó un aumento de HSCs después de tratar a los animales con HGF, hecho que indica que HGF no tienen un efecto movilizador de las HSCs hacia sangre periférica, sugiriendo que el elevado número de células EGFP+ observadas en el riñón podría asociarse a que HGF ejercería un efecto localizador del daño, induciendo el homing de estas células hacia el lugar del daño.
De acuerdo con el posible papel localizador que ejercería HGF en el riñón diabético, se analizó por immunohistoquimia los niveles de expresión de SDF-1 en el riñón en los diferentes grupos de tratamiento. Se observó cómo la terapia génica con HGF hacía aumentar de manera significativa la expresión de SDF-1 en el riñón diabético y, en consecuencia, favorecía el homing de las células CXCR4+ (HSCs) en el riñón. De esta manera se demuestra que HGF tiene un papel localizador del daño y atrae, indirectamente y mediante el aumento de la expresión de SDF-1, las HSCs hacia el riñón diabético.
De manera que, al combinar la terapia génica con HGF con la administración de G-CSF se daba un aumento aún más pronunciado del número de células EGFP+ en el riñón, pues G-CSF moviliza estas células desde la médula ósea hacia la sangre periférica, mientras que HGF induce su reclutamiento en el lugar del daño.
Se observó que la terapia génica con HGF reducía la expresión de citoquinas proinflamatorias (TNF-¿ o IFN-¿), y estaba asociado a un número elevado de macrófagos M2 (regenerativos) en el glomérulo, hecho que se demostró por la coexpresión de EGFP con Galectina-3 i Receptor de Manosa. Estos resultados nos hacen pensar que HGF induciría un entorno antiinflamatorio en el riñón que promovería la reparación y regeneración mediada por macrófagos de tipo M2.
Finalmente, para analizar una posible integración de células EGFP+ en la estructura del glomérulo, se realizaron immunofluorescencias con marcadores para cada uno de los tipos celulares que integran el glomérulo. De todos estos marcadores, sólo se observó coexpresión de EGFP con células epiteliales de la cápsula de Bowman (PECs) en una proporción muy pequeña (<0.5%). Estas células altamente especializadas son cruciales para la reparación de podocitos. En consecuencia, se observó que el porcentaje de podocitos estaba bien preservado en los animales tratados con HGF en comparación con los animales diabéticos no tratados. Nuestros resultados sugieren que estas células que expresan EGFP derivarían de un proceso de fusión celular por una razón importante: se encontró un infiltrado muy extenso de macrófagos alrededor de la cápsula de Bowman y, además, los macrófagos tienen la habilidad de fusionarse con otros macrófagos o con otros tipos celulares como células residentes renales, particularmente en respuesta a estímulos inflamatorios. Por tanto, nuestros resultados sugieren que HGF atrae a las células derivadas de la médula ósea alrededor de la cápsula de Bowman y estas células se pueden fusionar con PECs y probablemente ayudan al proceso de reparación.
En conjunto, todos estos resultados obtenidos aportan más conocimiento a los mecanismos de reparación inducidos por HGF y abren nuevas oportunidades de inducir la regeneración renal en la nefropatía diabética.
