Deciphering the dna methylome of normal and neoplastic b cells
- Autores: Marta Kulis
- Directores de la Tesis: Jose Ignacio Martin Subero (dir. tes.), Elías Campo Güerri (tut. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2014
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Rafael Oliva Virgili (presid.), Miguel Angel Peinado Morales (secret.), Luciano Di Croce (voc.)
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
RESUMEN:
La metilación del ADN es una marca epigenética que juega un papel importante no solo durante el desarrollo y la diferenciación celular normales, sino también en condiciones patológicas como la transformación tumoral. Varios estudios publicados con anterioridad han demostrado que los patrones de metilación del ADN se modifican durante la maduración de las células B normales y también en las células B neoplásicas. Sin embargo, la gran mayoría de esos estudios se enfocaban en el análisis de las regiones promotoras que contenían las islas CpG (ICG). De hecho, la hipermetilación de la región promotora de los genes supresores de tumores es una de las características más ampliamente reconocidas en el cáncer. En la actualidad, las nuevas técnicas epigenómicas permiten analizar el metiloma del ADN de una manera no sesgada, y sus aplicaciones iniciales han comenzado a revelar que las funciones de la metilación son más amplias que las reconocidas con anterioridad. Por lo tanto, el objetivo principal de esta tesis doctoral es el de proporcionar una caracterización exhaustiva de los cambios de la metilación del ADN en las células B normales y neoplásicas. Para ello, se utilizarán la secuenciación de bisulfito de todo el genoma y los microarrays de alta densidad para estudiar múltiples subpoblaciones de células B normales (Estudio 1) y dos neoplasias de células B maduras, la leucemia linfática crónica (LLC) (Estudio 2) y el mieloma múltiple (MM) (Estudio 3).
En el Estudio 1, se analizó el metiloma de diez subpoblaciones de células B en diferentes estadios de diferenciación, desde las células progenitoras hematopoyéticas (CPHs) hasta las células plasmáticas (CPs) terminalmente diferenciadas. Se observó que el proceso de diferenciación de las células B implica una modulación masiva de la metilación del ADN, la cual afecta a más de 4.6 millones de sitios diferencialmente metilados. Desde las CPHs hasta las CPs, el proceso de diferenciación se asocia con una pérdida gradual de metilación. También se identificó que la metilación fuera del contexto de los dinucleótidos CpG está restringida prácticamente al estadio de CPH. En cambio, la metilación de los dinucleotidos CpG mostraba una modulación mas compleja durante toda la maduración de las células B. Los cambios en la metilación de los CpGs no se distribuían al azar a lo largo del genoma sino que principalmente afectaban a los enhancers, la heterocromatina y las regiones reprimidas mediante el complejo polycomb. La pérdida de metilación de CpGs observada desde CPH hasta las células de centro germinal (CG) estaba enriquecida en enhancers que contenían sitios de unión de factores de transcripción (FTs) clave para las células B. Este fenómeno afectaba a genes relevantes para el sistema inmune que a su vez mostraban niveles de expresión variables en diferentes células B. Por el contrario, la desmetilación de la heterocromatina y la ganancia de metilación en las áreas reprimidas por el complejo polycomb no tenían ningún impacto funcional claro para las células B. Estos cambios de metilación del ADN se encontraban principalmente en las células B de larga vida y también estaban presentes en el contexto de las células B neoplásicas. Por lo tanto, al parecer, estos cambios podrían representar una deriva epigenética asociada con la vida prolongada de estas células. En conclusión, este estudio reveló que la diferenciación de las células B se asocia a una remodelación global del metiloma del ADN, y que cada etapa de maduración se caracteriza por una huella epigenética especifica.
El objetivo del estudio 2 fue la caracterización del metiloma del ADN de 139 pacientes con LLC pertenecientes a dos subgrupos clínicos: LLCs con IGHV mutada o no mutada (M-LLC o U-LLC, respectivamente). Se encontró que estos dos subtipos moleculares de LLC tenían un metiloma diferente, lo cual parecía representar una huella epigenética asociada a células B normales en diferentes grados de maduración. En particular, las U- LLCs se asemejaban a las células B pre-CG (por ejemplo, las células B naive), mientras que M-LLCs eran más similares a las células B post-CG (por ejemplo, las células B de memoria). En general, el cambio más frecuente observado en la LLC en su conjunto fue la hipometilación del ADN dentro del cuerpo de gen. Se demostró que esta hipometilación estaba enriquecida en regiones de enhancer que son dianas de FTs relacionados con el sistema inmune. También se descubrió que la metilación del ADN intragénico en la LLC podría estar implicada en el splicing alternativo y el uso de promotores alternativos. Por último, se definió una firma epigenética que permitía distinguir nuevos subtipos de LLC con diferentes características biológicas y comportamiento clínico. Según esta firma, los casos de LLC se pueden clasificar en tres grupos en base a su similitud epigenética con distintos subtipos de célula B: las LLCs parecidas a células naive, las LLCs parecidas a células memoria y el grupo con patrones de metilación intermedios. En conclusión, se identificó que la metilación diferencial en el cuerpo del gen puede jugar un papel importante en la transformación de la LLC, ya que muestra implicaciones tanto funcionales como clínicas.
El Estudio 3 se centró en el papel de la metilación del ADN en la patogénesis del MM. Se analizaron las CPs neoplásicas purificadas de una gran serie de pacientes con MM, así como de pacientes afectados del estadio premaligno conocido como gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI). En comparación con las CPs normales, las CPs neoplásicas mostraron una hipometilación global, que en su mayoría afectaba a regiones de heterocromatina, siendo este fenómeno más pronunciado en MM que en GMSI. La hipermetilación del ADN era menos extensa que la hipometilación pero, inesperadamente, afectaba a enhancers intrónicos fuera de ICGs en vez de a ICGs en regiones promotoras. En base a la literatura, esta es la primera vez que se encuentra esta alteración epigenética en el contexto del cáncer. La hipermetilación de los enhancers se asociaba con una reducción de la expresión de los genes asociados y con una neutralización de la actividad de dichos enhancers, ya que desaparecían los sitios hipersensibles a la DNAsa I y las modificaciones de histonas especificas para los enhancers tales como la H3K4me1 y la H3K27ac. Los enhancers hipermetilados contenían sitios de unión de FTs específicos para las células B y se demostró que la adquisición aberrante de la metilación del ADN en estas regiones se asociaba con el silenciamiento de FTs concretos. Las regiones hipermetiladas identificadas en MM también mostraban metilación en las células madre y se desmetilaban gradualmente durante la diferenciación de las células B. Esta hipermetilación de enhancers no era específica para el MM, ya que se pudo identificar también en otras neoplasias de células B como el linfoma difuso de células B grandes. Estos hallazgos sugieren que la hipermetilación del ADN de los enhancers regulados durante el desarrollo es una modificación epigenética nueva asociada con la patogénesis del MM y otras neoplasias de células B.
