Molecular charaterization of uncommon types of liver cancer through integrative genomic analysis
- Autores: Helena Cornella Vives
- Directores de la Tesis: Josep Llovet i Bayer (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Antoni Castells (presid.), Ivo Glynne Gut (secret.), Peter R. Galle (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El cáncer es una de las principales causas de muerte en las zonas desarrolladas, y se ha estimado que en las próximas décadas lo va a ser también a nivel mundial. Los tumores hepáticos representan la segunda causa de muerte entre los pacientes de cáncer, y la decimosexta a nivel global. El término cáncer hepático incluye el carcinoma hepatocellular (CHC), el cholangiocarcinoma hepatocellular (CCA) y el carcinoma fibrolamellar (FLC). El CHC es el mayoritario afectando a un 90% de los casos, y ha sido ampliamente estudiado a nivel molecular lo que ha permitido la identificación de distintas subclases moleculares y de las alteraciones genómicas asociadas. Éste conocimiento abrió la posibilidad de una mejor caracterización de esta enfermedad y de la identificación de dianas potencialmente terapéuticas mediante tratamientos moleculares. No obstante, los perfiles moleculares del subtipo de CCA intrahepático (iCCA) y del FLC han sido poco o no estudiados, siendo estos tumores hepáticos igualmente devastadores aunque menos comunes. Así pues, la hipótesis de esta tesis fue que el estudio molecular de estos dos cánceres hepáticos minoritarios podrían llevar a la mejora en el manejo y tratamiento clínico de sus pacientes.
En los estudios presentados nos planteamos evaluar de forma exhaustiva el perfil molecular del iCCA y del FLC, así como del mecanismo de acción de algunas de las potenciales dianas terapéuticas identificadas en el estudio genómico del iCCA, en concreto el de la enzima IDH mutada.
Mediante los estudios presentados obtuvimos los siguientes resultados:
Primer estudio: El análisis molecular integrativo del colangiocarcinoma intrahepático desvela dos clases moleculares con distintos pronósticos. Gastroenterology, 2013 Apr; 144(4):829-40 1. El iCCA se puede estratificar en dos subclases moleculares distintas y robustas. La de Proliferación que engloba el 62% de la cohorte y está enriquecida en firmas genéticas oncogénicas (EGFR, HER2, MET, MARK, VEGF y PDGF), firmas de HCC de mal pronóstico (Cluster A78, G3-proliferation64 y S179) y firmas de células progenitoras también relacionadas con el HCC (S279). La segunda subclase, la denominada Inflamación está caracterizada por la activación de STAT3 y la desregulación de citoquinas y genes vinculados con la inflamación (IL4, IL3, IL10, IL8 y IL13).
2. Las características clínico-patológicas muestran que la subclase de Inflamación presenta mejor pronóstico que la de Proliferación, la cual tiene un tiempo de supervivencia y de recurrencia menor (24.3 meses vs. 47.2 y 15 vs. 37, respectivamente). Así mismo los tumores de Proliferación presentan un patrón histológico de diferenciación más pobre e invasión intraneural.
3. Se identificaron varias alteraciones cromosómicas en el iCCA. Las más relevantes fueron las amplificaciones génicas en las zonas cromosómicas 1p13.1, 1p31.3, 11q13.2 y 11q13.2, y las deleciones en 9p21.3 y 14q22.1. Éstas aberraciones afectan genes relevantes cómo FGF19, ROR1, ORAOV1, CCND1, SAV1, TSC1 y CDKN2A. Una vez integramos éstas alteraciones cromosómicas a la clasificación molecular, las dos clases transcripcionales fueron mejor definidas subdividiéndose cada una de ellas en 3 subclases.
4. Mediante el análisis mutacional en zonas puntuales encontramos mutaciones activadoras en 12 de los 147 iCCA secuenciados en el exón 1 del gen KRAS, en 5 del exón 15 de BRAF siendo 3 de estas en V600E, en 2 del exón 21 de EGFR y en 1 paciente del exón 7 de TP53.
5. Se generó una firma genética asociada a peor pronóstico, la cual resultó ser enriquecida en la clase de Proliferación.
Así pues este estudio permitió la identificación de dos subclases moleculares distintas a nivel transcripcional, biológico y pronóstico para el iCCA, y de alteraciones genómicas como potenciales dianas terapéuticas.
Segundo estudio: La forma mutada de IDH inhibe HNF4a interrumpiendo la diferenciación hepatocitaria y promoviendo la formación de colangiocarcinoma intrahepático. Nature, 2014 Sep 4; 513(7516):110-4.
1. Los hepatoblastos (HBs) mutados por IDH no son capaces de diferenciarse a hepatocitos dada la producción del metabolito 2HG. Ésta capacidad es restaurada por el tratamiento de ML309, inhibidor de IDH mutado. No obstante la diferenciación biliar no es alterada.
2. El perfil transcripcional de los HBs mutados en IDH muestra una infraexpresión significativa del gen HNF4a y sus genes diana, siendo estos restablecidos por el tratamiento de ML309. Estos resultados fueron validados por qRT-PCR, Western-Blot e inmunofluorescencia.
3. Dos aproximaciones in vitro demostraron la implicación de HNF4a en la diferenciación hepatocitaria. En la primera los HBs WT con HNF4a silenciado mostraron diferenciación biliar pero no hepatocitaria. En cambio, en las segunda aproximación los HBs mutados por IDH con expresión ectópica de HNF4a si se diferenciaron a hepatocitos.
4. El modelo animal genéticamente modificado (GEMM) que sobreexpresaba IDH mutado en hepatocitos adultos en condiciones de daño hepático mostró defectos en la respuesta hepática frente a éste daño mediante incapacidad de diferenciación hepatocitaria, bajos niveles de HNF4a y una proliferación aberrante del parénquima hepático.
5. Este mismo modelo pero en células biliares SOX9+ mostró a los 20 meses acumulación de células hepáticas progenitoras lejos de conductos biliares y estructuras porta. Esto demuestra la incapacidad de las células progenitoras a diferenciarse a hepatocitos.
6. Otro GEMM con HNF4a silenciado y bajo condiciones de daño hepático mostró expansión de células hepáticas progenitoras y generación de iCCAs.
7. El doble modelo GEMM que sobreexpresaba IDH y KRAS mutado mostró expansión de células ovales, desarrollo de lesiones premalignas y iCCAs a las 50 semanas de media, mientras que en el GEMM que sólo sobreexpresava KRAS mutado eran necesarias 82 semanas de media.
Así pues este estudio demuestra que el IDH mutado no permite la diferenciacíon de los HBs a hepatocitos dada la producción de 2HG y la inhibición de HNF4a, aunque esto no afecta la diferenciación colangiocitária. Asimismo, y mediante el estudio de distintos modelos animales, demostramos que IDH actúa sinérgicamente con otras lesiones como las mutaciones de KRAS en el desarrollo de iCCA, siendo IDH un gatekeeper de esta tumor.
Tercer estudio: El análisis genómico integrativo del carcinoma fibrolamellar revela su característico perfil molecular.
1. El FLC se divide a nivel transcripcional en 3 subclases moleculares distintas. La de Proliferación que define el 51% de la cohorte y está enriquecida en firmas genómicas de cánceres hepáticos relacionadas con características de proliferación (iCCA-Proliferation, HCC-G2), y en la activación de mTOR. La segunda subclase, Inflamación-26%, está caracterizada por la desregulación de citoquinas (IL10 y IL8) y firmas genéticas de inflamación (iCCA-Inflammation), y la última clase molecular, Unannotated, se caracteriza por firmas genéticas relacionadas con el perfil genómico de distintos cánceres, pero no de los característicos de hígado.
2. En un 94% de los tumores de FLC analizados se encontró sobreexpresión de alguno de los marcadores endocrinos NTS, CALCA, PCSK1 o DNER. Además, el marcador CALCA es encontró significativamente enriquecido en la subclase de Inflamación, y DNER en las de Proliferación e Inflamación. Comentar que los niveles de proteína de EGFR fueron también elevados en la mayoría de los FLCs, siendo estos heterogéneamente distribuidos entra las 3 clases moleculares.
3. El 98% de los FLCs mostraron marcaje positivo por el marcador hepatocitario HepPar1, y el 90% por el cholangiocitario K7. En referencia a los marcadores progenitores, el 21% fue positivo por K19 y el 24% por EpCAM. La integración de éstos resultados en nuestra clasificación molecular mostró un enriquecimiento significativo de marcaje positivo de EpCAM en la clase de Proliferación y una disminución aunque no significativa de marcadores progenitores para la subclase Unannotated.
4. El FLC presenta pocas alteraciones cromosómicas, siendo las ganancias en el cromosoma 19 y las pérdidas en el 19 y 22q las más comunes. En referencia a las alteraciones cromosómicas focales, las ganancias más frecuentes fueron en 8q24.3 y las perdidas en 22q13.32 y 19p13 afectando genes relevantes como el TSG STK1. Además, ésta última deleción se ha descrito cómo la causante de la recientemente publicada proteína de fusión DNAJB1-PRKACA que observamos en el 79% de nuestros casos de FLC.
5. Los resultados del análisis de WES de la muestra fresca de FLC revelaron 23 mutaciones dañinas, las cuales afectaron genes poco comúnmente mutados en los cánceres de hígado cómo el TSGBRCA2 (4.2%, 2/47). No obstante, ningunas de las mutaciones más prevalente en HCC o iCCA fueron halladas en el FLC (i.e. TP53, CTNNB1, ARID1A, TTN, NFE2L2, AXIN1, EGFR, BRAF, KRAS, NRAS, IDH1 y IDH2).
6. Se ha generado un firma genética que predice supervivencia y recurrencia en los pacientes de FLC formada por 8 genes (i.e. PEAR1, KRTAP, KLRD1, OSBPL8, RPL32, SLC26A11, RGS11 y RAPGEF1) la cual fue validada en una cohorte independiente.
Así pues el FLC se define en 3 subclases moleculares distintas y robustas, presenta un patrón de diferenciación patológico dual (heptocitario y colangiocitario) y muestra unas alteraciones genómicas estructurales únicas caracterizadas por pocas y particulares aberraciones cromosómicas, un patrón mutacional concreto y una elevada prevalencia del transcrito de fusión DNAJB1-PRKACA.
En conclusión, identificamos un claro patrón molecular característico de cada uno de les tumores estudiados así como distintas alteraciones genómicas potencialmente responsables de su aparición y desarrollo apuntando a algunas de ellas como dianas terapéuticas. También planteamos la posibilidad de seleccionar los pacientes según su perfil molecular para obtener una mayor respuesta anti-tumoral. Además, identificamos el mecanismo de acción del IHD mutado en la generación del iCCA.
