Resumen de Mecanismos de regulación de la conjugación del plásmido r27, prototipo de los plásmidos inchi1
R27 es el prototipo de los plásmidos IncHI1, que han sido asociados a la diseminación de múltiples resistencias a antibióticos entre bacterias patógenas. La transferencia de estos plásmidos es termodependiente y los genes implicados en su transferencia se encuentran agrupados en seis operones (operones tra). Se conoce muy poco acerca de los factores involucrados en la regulación de la conjugación de R27. Esta tesis describe en un primer trabajo el estudio transcripcional de los seis operones tra. Nuestros resultados indican que HtdA, codificado en el plásmido R27, está implicado en la represión transcripcional de cuatro de los operones tra (F, H, AC y Z), denominados R27-dependientes; así como la existencia de un ¿crosstalk¿ entre HtdA y otros factores reguladores desconocidos codificados por el propio plásmido.
Estos otros factores, necesarios para la correcta expresión de los genes tra, han sido identificados en un segundo trabajo. Utilizando librerías de R27 y ensayos de mutagénesis al azar, se han identificado dos genes, trhR y trhY, esenciales para la expresión transcripcional de los cuatro operones tra R27-dependientes y por lo tanto para la conjugación de R27. TrhR y TrhY son necesarias de forma simultánea y su actividad estimuladora se ve contrarrestada por HtdA. Las interacciones físicas y funcionales detectadas entre TrhR, TrhY y HtdA sugieren que estos tres elementos forman parte de un circuito regulador que controla la conjugación y se encuentra altamente conservado entre los plásmidos IncHI. Estudios de expresión sugieren que la represión de la conjugación ejercida por H-NS a elevada temperatura podría producirse via la represión de la expresión de trhR.
En un tercer trabajo estudiamos el efecto del estado fisiológico de la célula en la conjugación de R27, encontrando que la transferencia del plásmido es mayor cuando las células donadoras se encuentran en fase logarítmica, mientras que el estado fisiológico de las células receptoras no afecta a la conjugación. Mediante un análisis transcriptómico en fase logarítmica y estacionaria determinamos que la mayoría de los genes implicados en la transferencia están inducidos en fase logarítmica. Los reguladores de fase estacionaria, ppGpp y RpoS y la proteína H-NS no son los responsables del efecto de la fase de crecimiento en la conjugación del plásmido. Sin embargo, el circuito regulador TrhR-TrhY/HtdA sí que juega un papel importante en la dependencia de fase de crecimiento que presenta la transferncia de R27. Fluctuaciones en los niveles del antiactivador HtdA y por tanto de las proteínas activadoras TrhR-TrhY en función del estado fisiológico de la célula explicarían esta regulación. Nuestros resultados sugieren que el complejo CRP-cAMP, sensor fisiológico y metabólico, es responsable de la regulación de la expresión de HtdA.
Un cuarto trabajo nos permitió profundizar en la termorregulación de R27, mediante un estudio transcriptómico comparando el patrón de expresión de los 206 genes anotados para R27 a temperatura permisiva (25°C) y no permisiva (37°C) de conjugación. También se analizaron los efectos de una mutación htdA en el perfil de expresión global del plásmido R27. Los resultados obtenidos están de acuerdo con el modelo anteriormente descrito de la regulación de la conjugación de R27. A temperatura no permisiva de conjugación (37°C), cuando H-NS se encuentra reprimiendo los genes tra de R27, no se observa efecto de HtdA. Por otro lado, a la temperatura permisiva (25°C), HtdA provoca una represión global, no afectando sólo a los operones tra sino a la mayor parte de los genes de R27.
En un último trabajo se aplicó a R27 una estrategia de triple marcaje para visualizar la distribución espacial de las células transconjugantes, donadoras y receptoras en la colonia mediante microscopía de epifluorescencia y confocal. Además, esta metodología pudo ser utilizada para cuantificar frecuencias de conjugación en medio líquido mediante citometría de flujo.
