Estudio del regulón hha-dependiente en enterobacterias

• Autores: Carla Solórzano González
• Directores de la Tesis: Cristina Madrid Xufré (dir. tes.), Sònia Paytubi Casabona (codir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2015
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Laura Baldoma (presid.), Susana Campoy Sánchez (secret.), Gloria del Solar Dongil (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Proteínas
  • Ciencias de la vida
    • Genética
    • Microbiología
      • Fisiología bacteriana
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• Resumen

  • as proteínas de la familia de tipo Hha participan, a través de la formación de complejos con la proteína H-NS, en la regulación de la expresión de genes adquiridos horizontalmente (HGT) en Enterobacterias. Entre ambas proteínas existen residuos que son importantes para dicha interacción, siendo el residuo R12 esencial en el caso de H-NS. En esta investigación se ha identificado el residuo D48 de la proteína Hha como fundamental para su interacción con H-NS. La mutación hhaD48N impide la interacción entre ambas proteínas. Así mismo, se ha determinado que la proteína HhaD48N se une a StpA, parálogo de H-NS, incluso con mayor afinidad que la proteína Hha salvaje. El empleo de la proteína HhaD48N constituyó una estrategia clave para determinar por primera vez el grupo de genes que son regulados por la proteína Hha de manera independiente a su interacción con H-NS. En este trabajo se realizaron por un lado, estudios transcripcionales mediante microarrays a partir de cultivos en fase exponencial (DO600 0.6), en medio LB y a 37°C, utilizando la cepa de E. coli MG1655 y los mutantes ¿hha y hhaD48N y la cepa S. Typhimurium SV5015 con las mutaciones hha, hhaD48N y stpA. Por otro lado, se realizó una inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) utilizando diferentes variantes de la proteína Hha y diferentes fondos genéticos de Salmonella. El análisis transcriptómico realizado en E. coli no proporcionó resultados concluyentes. En el caso de S. Typhimurium, del conjunto de genes que presentaron distinta expresión en la cepa mutante ¿hha respecto a la cepa salvaje, 120 (73 inducidos y 47 reprimidos) fueron considerados como genes presuntamente regulados por Hha de manera independiente a H-NS o StpA, siendo el 38% ADN HGT. Este grupo se determinó considerando aquellos genes desregulados en el mutante ¿hha respecto a la cepa salvaje, y que en cambio no se vieran afectados en las cepas hhaD48N y ¿stpA respecto la cepa salvaje. En este grupo, se encuentran genes relacionados con la síntesis de sideróforos, motilidad y con islas de patogenicidad. La mutación hha causa una ligera disminución de la presencia de sideróforos en el medio de cultivo, siendo este efecto dependiente de Hha e independiente de H-NS. Los ensayos de motilidad en diferentes fondos genéticos ponen de manifiesto que la proteína Hha está implicada en la regulación de la motilidad en Salmonella, de manera independiente a su interacción con H-NS/StpA mediante la regulación a nivel del motor flagelar. Así mismo, la proteína Hha reprime la expresión de los genes ssrA y ssrB, y por lo tanto de los genes de la isla de patogenicidad SPI-2, de manera independiente a su interacción con H-NS en condiciones extracelulares, mientras que en condiciones intracelulares la regulación es dependiente del complejo Hha/H-NS. La proteína Hha está implicada en la modulación de la expresión del principal regulador de la isla de patogenicidad SPI-1, HilA, tanto formando complejos con H-NS como de manera independiente a dicha interacción. Los resultados obtenidos en los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina y posterior secuenciación sugieren que la proteína Hha se une a un gran número de secuencias a lo largo del cromosoma de Salmonella. La agrupación de dichas secuencias en categorías funcionales muestra una gran coincidencia con las categorías funcionales de los genes identificados como Hha-dependientes H-NS/StpA independientes identificados mediante el análisis transcriptómico. Los resultados que se desprenden de ambas aproximaciones indican por un lado que la proteína Hha ejerce un papel como regulador independiente de H-NS/StpA en S. Typhimurium bajo determinadas condiciones ambientales y por otro lado confirman su papel relevante en la regulación de la expresión de material genético adquirido horizontalmente.