Resumen de Genetic and evolutionary determinants of mutation rate in bacteriophage φx174
La mutación es la fuente última de variabilidad genética y por eso es fundamental en la evolución de los organismos. Aunque la variabilidad genética es necesaria para la adaptación, la mayoría de las mutaciones suelen ser deletéreas y por tanto tienden a reducir la eficacia biológica de las poblaciones debido al lastre genético. La teoría predice que, como consecuencia del equilibrio entre adaptación y lastre genético, debe existir un valor intermedio para la tasa de mutación que permita maximizar el éxito evolutivo, o tasa óptima de mutación.
En general, los virus son uno de los modelos más usados en biología y en particular en biología evolutiva. Esto es debido a una serie de características como son: i) su pequeño tamaño genómico, que hace sencillo comprender las bases moleculares de su evolución y realizar modificaciones genéticas in vitro; ii) sus grandes tamaños poblacionales y su rápida tasa de crecimiento, que permiten cultivarlos fácilmente y realizar muchas réplicas independientes; y iii) sus elevadas tasas de mutación, que los hacen evolucionar rápidamente permitiéndonos estudiar la evolución en tiempo real.
Las tasas de mutación virales varían entre 10–8 y 10–4 sustituciones por nucleótido por ronda de replicación (s/n/r) y dependen, en gran parte, de las enzimas implicadas en la replicación. Las ARN polimerasas ARN dependientes (RdRp) y las retrotranscriptasas (RT) presentan las mayores tasas de mutación descritas debido a la ausencia de actividad correctora de errores 3'exonucleasa, lo cual en parte explica que los virus que presentan estadios de ARN en su ciclo de infección tengan tasas de evolución más rápidas que los organismos con genoma de ADN.
Sin embargo, hay otros procesos que pueden afectar la tasa de mutación tales como el mecanismo de replicación, la presencia de agentes oxidantes e incluso la introducción de mutaciones mediada por enzimas citidina desaminasas del hospedador de la familia APOBEC3, por citar algunos ejemplos.
Pese a la variedad de factores que pueden modular la tasa de mutación, se ha observado que los organismos que poseen ADN como material genético, incluyendo los virus de ADN, las bacterias y los eucariotas unicelulares, presentan una tasa de mutación por genoma de alrededor de 0,003 sustituciones por genoma y ronda de replicación, lo cual implica que la tasa de mutación está inversamente relacionada con el tamaño del genoma. Esta relación entre tasa de mutación y tamaño genómico se conoce como regla de Drake. Por ejemplo, la mayoría de bacterias tienen tamaños genómicos superiores a 1000 kb y tasas de mutación menores que 10–9 s/n/r. Sin embargo, los bacteriófagos de ADN de cadena sencilla, como φX174 y m13, suelen tener unos tamaños genómicos de aproximadamente 6 kb y sus tasas de mutación son del orden de 10–6 s/n/r. El bacteriófago φX174 y otros virus de ADN de cadena sencilla son modelos interesantes para realizar estudios de tasas de mutación y adaptación debido a que sus tasas de mutación son de las más altas entre los virus de ADN y, además, estos virus utilizan la polimerasa del huésped para la replicación viral. Por tanto, el objetivo principal de esta tesis doctoral consistió en investigar los mecanismos de regulación de la tasa de mutación que no dependen de la polimerasa viral, utilizando el bacteriófago φX174 como sistema modelo.
En un trabajo anterior (Domingo-Calap et al., 2012), demostramos que el bacteriófago φX174 desarrolló resistencia al análogo de nucleósido 5-fluorouracilo (5-FU) y que esta resistencia estaba mediada principalmente por sustituciones en el gen que codifica para la proteína de lisis E. Estos resultados nos permitieron plantear la hipótesis de que la acumulación de mutaciones en el genoma viral podría reducirse por cambios en el tiempo de lisis. Para ello, primero diseñamos y construimos una serie de mutantes que portaban remplazamientos del dominio N-terminal de la proteína E mediante mutagénesis dirigida y, a continuación, realizamos varios ensayos para caracterizar diferentes etapas del ciclo viral o rasgos de historia de vida (como, por ejemplo, el tamaño de la progenie, el tiempo de lisis, la tasa de crecimiento, entre otros) y la tasa de mutación de dichos mutantes y el virus silvestre. Los resultados de estos experimentos mostraron que aproximadamente la mitad de los mutantes ensayados producían un aumento en el tiempo de lisis, y dos de ellos (V2A y D8A) también producían resistencia al 5-FU. Los resultados mostraron que un retraso en el tiempo de lisis produjo un incremento del tamaño de la progenie en presencia de 5-FU, explicando el aumento de la eficacia biológica (medida como la tasa de crecimiento) en presencia del mutágeno. Además, estas mutaciones redujeron aproximadamente a la mitad la tasa de mutación comparado al virus silvestre según las estimaciones obtenidas a partir de pruebas de fluctuación en presencia de 5-FU. Finalmente, propusimos un modelo matemático sencillo que se ajusta a los datos observados y explica que un aumento de la progenie, como consecuencia de un mayor tiempo de lisis, permite al virus reducir el número de ciclos de infección necesarios para expandir su tamaño poblacional. En consecuencia, el número de ciclos de replicación en el cual las mutaciones pueden acumularse disminuye contrarrestando el efecto mutagénico del 5-FU y contribuyendo a la resistencia del virus.
La tasa de mutación de φX174 sugiere que el fago evita los mecanismos de reparación post replicativos de E. coli, como el sistema de reparación de apareamientos incorrectos dependiente de la metilación del ADN (MMR por sus siglas en inglés). A diferencia de su hospedador, el fago φX174 no contiene sitios GATC, los cuales son necesarios para la acción del sistema MMR. En un estudio previo (Cuevas et al., 2011) encontramos que la introducción de siete sitios GATC produjo una reducción de treinta veces en la tasa de mutación. Además, el efecto sobre la tasa de mutación se anuló en células mutD, que son deficientes en MMR, indicando que el efecto de los sitios GATC estaba relacionado con la acción del sistema MMR.
Para estudiar la relación entre el sistema MMR y la tasa de mutación de φX174 diseñamos y construimos una serie de mutantes en los cuales el variamos el número y localización de sitios GATC en el genoma viral, incluyendo un mutante poseyendo el número de sitios GATC esperados por azar. Esto nos permitió no solo estudiar el efecto la reparación de apareamientos incorrectos en la tasa de mutación del bacteriófago φX174 sino también como afecta a su capacidad adaptativa.
Los resultados de las pruebas de fluctuación mostraron que la restauración del número de secuencias GATC esperadas por azar redujo aproximadamente ocho veces la tasa de mutación sin alterar significativamente la eficacia biológica del virus. Sin embargo, la eficiencia de la maquinaria implicada en la reparación del ADN fue limitada por los bajos niveles de metilación del genoma viral. Además, al construir diferentes virus mutantes, cambiando la localización y el número de sitios GATC introducidos, observamos que los efectos sobre la tasa de mutación no eran aditivos y eran muy variables, con algunas combinaciones que alcanzaban una reducción de 50 veces en la tasa de mutación, hasta algunas que no tenían un efecto significativo. Las mayores reducciones en la tasa de mutación se encontraron en algunos GATC localizados en regiones intergénicas, sugiriendo que los impedimentos estéricos pueden afectar a la acción de las enzimas de reparación. Por otro lado, también observamos que el efecto de la introducción de GATCs en el genoma de φX174 es revertido bajo condiciones de estrés, como son el crecimiento a elevadas temperaturas y la exposición a 5-FU, lo cual sugiere que la adición de secuencias GATC hace al fago sensible al fenómeno de mutagénesis inducida por el estrés. Mientras que a 42°C la tasa de mutación del virus silvestre no fue alterada de forma significativa, la tasa de mutación del virus 20GATC fue significativamente mayor que la de dicho virus a 37°C y también que la del virus silvestre a 42°C. De forma similar, el mutágeno tuvo un mayor efecto sobre la tasa de mutación del virus 20GATC comparado al virus silvestre.
Con el fin de averiguar si la presencia de GATCs afecta a la capacidad evolutiva de φX174, realizamos experimentos de evolución experimental en condiciones constantes de baja y alta intensidad de selección. Para ello, primero realizamos 100 pases seriados en su hospedador natural, E. coli. Estas condiciones pretenden simular la intensidad de selección a la que naturalmente está expuesto φX174, al menos en nuestras condiciones de laboratorio. En segundo lugar, realizamos un nuevo experimento de evolución en un nuevo hospedador, Salmonella typhimurium, al cual φX174 no está adaptado y, por tanto, en el que las poblaciones virales estaban sometidas a una alta presión de selección. En ambos casos se evolucionaron cinco líneas independientes por virus y hospedador a partir de poblaciones ancestrales del virus silvestre y del mutante 20GATC. Mediante curvas de crecimiento estándar estimamos la eficacia biológica relativa a su correspondiente población ancestral. Los resultados de la evolución de las poblaciones derivadas del virus silvestre y del mutante 20GATC en E. coli mostraron similares trayectorias de la eficacia biológica a lo largo de la evolución. El análisis de las secuencias consenso de las poblaciones evolucionadas en E. coli reveló que la mayoría de los sitios GATC se habían mantenido, lo cual indica que, de haber una selección en contra de la presencia de sitios GATC, ésta es baja en nuestras condiciones experimentales. Por otro lado, también mostró que las poblaciones evolucionadas experimentaron un nivel de adaptación tras 100 pases de evolución en E. coli, aunque probablemente las diferencias en la eficacia de las mutaciones observadas fueron los suficientemente pequeñas para no poder detectarlas en nuestras condiciones de crecimiento.
Sin embargo, en la evolución de las poblaciones derivadas del virus silvestre y del mutante 20GATC en S. typhimurium observamos que las poblaciones del mutante 20GATC mostraron una menor capacidad de adaptación, ya que el incremento de la eficacia fue menor que el observado en las poblaciones del virus silvestre, indicando que la presencia de GATCs constriñe la adaptabilidad del virus. El análisis de las secuencias consenso de las poblaciones evolucionadas en S. typhimurium mostró que el número de mutaciones observadas al final de la evolución fue similar en ambas poblaciones. Sin embargo, algunas mutaciones paralelas en el gen de la proteína H con un potencial efecto beneficioso, puesto que han sido previamente descritas en trabajos de adaptación a Salmonella, se encontraban exclusivamente en las poblaciones evolucionadas a partir del virus silvestre, lo cual proporciona una posible base molecular para explicar la menor capacidad adaptativa de las poblaciones derivadas del mutante 20GATC.
En conclusión, los resultados obtenidos a partir de este trabajo contribuyen a dilucidar algunos mecanismos que permiten al bacteriófago φX174 regular su tasa de mutación para poder responder a las diferentes presiones de selección a las que puede estar sometido naturalmente.
