Resumen de Análisis prospectivo de selección inmunomagnética en espermatozoides para la mejora de los resultados de las técnicas de reproduccion asistida
ANÁLISIS PROSPECTIVO DE SELECCIÓN INMUNOMAGNÉTICA DE ESPERMATOZOIDES PARA LA MEJORA DE LOS RESULTADOS DE LAS TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA.
Introducción La infertilidad afecta a una de cada 5 parejas con la intención de concebir solucionado en parte por el desarrollo de las distintas técnicas de reproducción asistida (TRAs), aunque a pesar de los logros alcanzados, todavía existe un elevado porcentaje de casos en los que estas técnicas no son 100% efectivas o son necesarios repetidos intentos para lograr una gestación.
La responsabilidad del éxito reproductivo está compartida entre el gameto masculino y el femenino. Los gametos femeninos son el factor limitante en cualquier técnica de reproducción, ya que se generan muy pocos, cuesta mucho de obtenerlos y todos ellos se utilizan, por lo que en principio no va a ser posible seleccionarlos. Sin embargo, los espermatozoides pueden variar en número desde millones hasta cero, por tanto, en la mayoría de los casos encontramos una cantidad que excede a los ovocitos. Y además, todos ellos son distintos debido a la recombinación genética y la meiosis en la espermatogénesis.
Las técnicas actuales de selección de espermatozoides se basan fundamentalmente en la movilidad a través del swim up o de la centrifugación por gradientes de densidad o por la morfología del espermatozoide a través del criterio subjetivo del embriólogo en los procedimientos de micromanipulación. Pero a pesar de la evaluación macroscópica y microscópica de los espermatozoides, en las últimas décadas se ha asistido un progreso en el conocimiento y comprensión de los mecanismos bioquímicos y moleculares que regulan la producción de espermatozoides funcionalmente competentes. Se ha visto que distintos marcadores moleculares o procesos están implicados en la infertilidad masculina, por ejemplo, la apoptosis, la fragmentación del ADN, el estrés oxidativo, la ubiquitina, los receptores de platelet activated factor, los receptores del ácido hialurónico… Existe todavía un amplio margen de mejora en las distintas TRAs, y una de estas mejoras podría ser usando nuevas herramientas para la selección objetiva de espermatozoides. Seleccionando objetivamente un espermatozoide con las características moleculares adecuadas, en vez de seleccionarlo por su movilidad o morfología puede contribuir al éxito reproductivo. Esto significa la evolución de una selección subjetiva a una selección mejorada.
Nuevos métodos de selección espermática Distintas tecnologías pueden ser útiles para seleccionar, o separar físicamente células espermáticas con determinadas características moleculares o estructurales, de forma que se mantengan su viabilidad posterior y mejoren por tanto, los resultados finales. Algunas de estas son la Microinyección intracitoplasmática de esperma seleccionado morfológicamente (IMSI) que consiste en un análisis en tiempo real de la ultraestructura del gameto masculino vivo, usando un microscopio particularmente equipado (con ópticas Normaski y potenciado con un procesador digital de imágenes) que llega a ofrecer unos 6300 aumentos. El Hialuron binding assay: PICSI donde se estudia los efectos del ácido hialurónico (AH) y es una línea de investigación en relación con la maduración espermática. La electroforesis sistema de aislamiento espermático basado en la separación electroforética de estas células en base a su tamaño y carga, siendo lo de mejor calidad los más electronegativos y los de menor tamaño. La birrefringencia Basándose en una aproximación similar a la del IMSI, pero con la idea de evaluar la distribución de las organelas de los espermatozoides en la cabeza, pieza media y cola, se plantea para el ICSI el uso de un microscopio invertido polarizado con un sistema óptico nuevo y adaptado al espermatozoide como una herramienta nueva para la selección del mejor espermatozoide, basada en la birrefringencia de éste, ya que su textura protoplásmica tiene propiedades anisotrópica asociado a la organización longitudinal y fuerte compactación de los filamentos de las nucleoproteínas y por la organización también longitudinal de los filamentos subacrosomales se produce en la cabeza del espermatozoide maduro un fuerte efecto de birrefringencia.
Pero la piedra angular de este trabajo es la nueva tecnología Magnetic activated cell sorting; MACS La selección celular inmunomagnética o MACS utilizada ya clínicamente con éxito en distintos ámbito, como el aislamiento de células progenitoras raras de sangre de cordón umbilical, y el uso de sangre periférica para sustituir a la medula ósea para el trasplante en pacientes tras quimioterapia o radioterapias. Distintos procesos o fenotipos moleculares son candidatos a ser utilizados como base de la separación molecular en espermatozoides aplicando está tecnología, y para ello, deben ser marcadores de membrana, y haber estado relacionados con la infertilidad masculina en trabajos previos de forma que su presencia es diferente en espermatozoides de varones infértiles.
Se basa en el uso de micropartículas magnéticas de aproximadamente 50 nanómetros de diámetro, los MicroBeads (MB) conjugadas con proteínas o anticuerpos (Ac.) específicos para su unión a las células o marcadores de interés. Requieren unas columnas para separar físicamente las células en función de si están o no marcadas, debido a su pequeño tamaño requieren un intenso campo magnético creado en la matriz de la columna, suficiente para retener las células unidas con una mínima cantidad de MB, mientras que las células no unidas pasan a través de la columna y pueden ser recogidas. Las células unidas pueden posteriormente ser liberadas de la columna mediante lavados. Ambas fracciones son separadas con elevada pureza, manteniendo su estructura, función óptima y viabilidad. La selección puede ser positiva, si las células que consideramos óptimas son aquellas marcadas por los MB y retenidas en la columna, o selección negativa si aquellas que no tienen el marcador molecular en cuestión y eluyen a través de la columna son las que vamos a utilizar, pues son las óptimas.
Figura 1- Esquema de una columna de separación celular magnética A. Columna de soporte sólido. B. Espacio por el que las células discurren. C. Las células marcadas son retenidas y las no marcadas eluyen.
El protocolo de la selección de espermatozoides combina 2 técnicas muy sencillas de aplicar con el propósito de aumentar los resultados de las TRAs.
La primera, el swim up para recuperar aquellos espermatozoides con elevada movilidad. La segunda, el MACS marca magnéticamente aquellos espermatozoides que expresen el marcador de membrana que estemos estudiando. Hay distintos marcadores potenciales de estudio con esta tecnología como la fosfatidilserina (PS), ubiquitina, receptores PAF… En el trabajo nos vamos a centrar en la PS, marcador temprano de la apoptosis. La apoptosis es un mecanismo bien caracterizado que se da en las células somáticas eucariotas para eliminar el material innecesario, viejo o aberrante.
No se conoce con exactitud si los marcadores apoptóticos detectados en los espermatozoides son residuos de un proceso apoptótico incompleto empezado antes de la eyaculación o son el resultado de una apoptosis iniciada después de la post-eyaculación, pero sí está demostrado que en el eyaculado hay espermatozoides con este proceso iniciado, y con las mismas características de motilidad y forma que los espermatozoides normales, lo que lleva a pensar que si los primeros fecundaran un oocito, inducirían un fallo reproductivo..
La externalización de la PS es uno de los acontecimientos más tempranos de la apoptosis, dependiente de Ca+2, la PS tiene alta afinidad por la Anexina V (AV), proteína de unión a fosfolípidos de 35-36 kDa y que sirve para la identificación de células con la integridad de la membrana comprometida (figura 2). Esta proteína conjugada con los MB se pueden unir magnéticamente a los espermatozoides con la membrana comprometida e identificar aquellos que estén en apoptosis o con el proceso apoptótico iniciado, éstos quedaran retenidos en las columnas y serán la fracción AV positiva y los espermatozoides que no estén unidos a las partículas paramagnéticas y que eluyen a través de la columna, la fracción AV negativa, serán los candidatos a ser utilizados como óptimos.
Figura 2 - Externalización de la PS y su unión con AV Objetivos Basándonos en los trabajos y conocimientos previos acerca de la infertilidad masculina y la apoptosis como uno de los factores moleculares que pueden influir en ella, nos hemos planteado como hipótesis de partida que eliminando los espermatozoides apoptóticos de muestras de semen de pacientes infértiles mejoraríamos la calidad de las mismas así como las tasas de éxito en las diferentes TRA en las que se utilizaran sin ningún efecto deletéreo sobre la salud de los RNV.
Para ello planteamos diferentes estudios: 1. Estudiar cómo afecta el MACS en la calidad espermática a través del espermiograma y de la oxidación y fragmentación del ADN y su relación con el éxito de los procedimientos en reproducción asistida.
2. Evaluar la influencia de la selección de espermatozoides no apoptóticos en el éxito reproductivo y su relación con la tasa de fecundación, tasa implantación, tasa de gestación y tasa de RNV y calidad embrionaria (morfología y morfocinetica). Para este objetivo realizaremos tres diseños de estudio; a través del estudio de cohortes ovocitaria, a través de un estudio prospectivo randomizado tanto en ovodon como en inseminación artificial y a través de un análisis de la calidad embrionaria mediante el sistema de time lapse (TMS) 3. Validar la seguridad y eficiencia de la técnica estudiando el efecto de la aplicación clínica de MACS en los resultados obstétricos y perinatales de los RNV.
Material y métodos 1) Estudio de la calidad seminal 1.1. Espermiograma Designamos un estudio en el que con 39 muestras en el grupo control y 43 en el grupo de estudio, describimos el efecto de la selección espermática con swim up y MACS sobre la calidad espermática, y la cuantificación en cuanto al número de espermatozoides perdidos durante el procedimiento.
El grupo control fue preparado mediante swim up y el grupo control después del swim up se le aplicó el MACS basándonos en la incubación de AVMB para eliminar aquellos espermatozoides apoptóticos, AV+.
1.2 Oxidación y fragmentación Previamente a la aplicación de las técnicas de selección realizamos un estudio de viabilidad y calidad encaminado a demostrar la seguridad que esta técnica ofrece mediante el estudio de la eficiencia de la separación inmunomagnética, a través del estudio de la fragmentación del ADN mediante el test del SCD donde se analizan 35 pacientes sometidos a TRA. Analizamos los espermatozoides de muestras obtenidas a partir de las fracciones antes y después de la capacitación por swim-up y de la fracción después de aplicar la separación inmunomagnética, tanto la fracción negativa como la positiva. Y también mediante el estudio de la oxidación del ADN mediante la citometría de flujo. Se analizan 54 pacientes sometidos a TRA. Se analizan los espermatozoides, de muestras de semen obtenidas por eyaculación, antes y después de su capacitación por swim-up y después de aplicar la separación inmunomagnética. En ellos se estudia el daño oxidativo a través de la formación de 8-hidroxideoxiguanosina (8-OHdG), utilizando el kit OxyDNA, conjuntamente con el uso de la citometría de flujo.
2) MACS y éxito reproductivo 2.1 Estudio de cohorte Designamos un estudio prospectivo de cohortes con ovocitos (n=406) de donantes sanas (n=30) que donaban a pacientes que iban a someterse a procedimiento de ICSI entre noviembre 2009 y enero del 2010. Concretamente, realizamos un estudio piloto con 30 muestras de semen, cada muestra se divide en 2, en una se aplicará el método de selección y el otra no (control) para estudiar la eficacia de la técnica sin perjudicar el ciclo.
Estudiamos la fecundación y el desarrollo temprano embrionario en D2 post ICSI y D3 post ICSI.
2.2. Estudios prospectivos 2.2.1. Inseminación artificial Combinamos ambas técnicas (swim up + MACS) y mediante un estudio prospectivo aleatorizado designamos el grupo control (n=116) y el grupo de estudio (n=123) entre diciembre 2009 y julio 2015.
Determinamos los niveles séricos de β-hCG que puede orientar en el diagnóstico de una gestación normal o anormal.
2.2.2. ICSI con donación de ovocitos Un total de 263 pacientes fueron asignadas mediante randomización (en proporción 1:1) para ser sometidas a tratamiento con MACS (grupo experimental) o preparación seminal convencional (grupo control) desde diciembre del 2010 hasta diciembre del 2012.
Un total de 2659 ovocitos MII donados fueron inseminados mediante el ICSI.
Estudiamos la fecundación 16-18h post ICSI y el desarrollo embrionario que fue evaluado a las 24 h con aumentos de 40x en el microscopio invertido.
La morfología embrionaria en términos de número de células, simetría de blastómeras, multinucleación y porcentaje de fragmentación, fueron evaluados en día 2 y día 3 (48-72h).
Los embriones viables son aquellos que fueron transferidos o vitrificados (en caso de aquellos supernumerarios para una eventual futura transferencia) en día 3 de desarrollo.
Además de las tasas de gestación, implantación y RNV.
2.3. Estudio de calidad morfocinética embrionaria mediante TMS Generamos 2 grupos antes de la microinyección, donde la muestra de semen del grupo de estudio fue preparada mediante el MACS (swim up + MACS) y el grupo control mediante el swim up. En el grupo de estudio incluimos 37 pacientes con 258 embriones y en grupo control incluimos 43 pacientes con un total de 243 embriones. Después de la microinyección, los ovocitos fueron cultivados de forma individualizada en placas de EmbryoScope® (EmbryoSlides).
Estudiamos los parámetros morfocinéticos que nos indican los rangos óptimos de división asociados a una mayor implantación.
3) MACS y RNV Analizamos los resultados obstétricos y perinatales de los RNV después de transferir embriones obtenidos a través de la selección de espermatozoides mediante MACS o mediante swim up del estudio prospectivo randomizado en ICSI ovodon previamente descrito. Obtuvimos notificación de los nacimientos de los ICSI realizados durante el periodo de octubre 2010- diciembre 2012, obteniendo información de 81,7% de ciclos en el grupo de MACS y 79,7% de ciclos en el grupo control.
Resultados 1) Estudio de la calidad seminal 1.2. Espermiograma Tabla 1: Parámetros estudiados en las distintas fracciones seminales.
Figura 3: Pérdida del total de móviles progresivos durante el procedimiento de MACS.
1.2 Oxidación y fragmentación Tabla 2: Oxidación espermática en las diferentes fracciones Tabla 3: Fragmentación espermática en las diferentes fracciones 2) MACS y éxito reproductivo 2.1 Estudio de cohorte Tabla 4: Fecundación, desarrollo embrionario y características morfológicas de dependiendo del método de selección empleado.
2.2. Estudios prospectivos 2.2.1. Inseminación artificial Las tasas de embarazo y sus IC95% fueron 19,0% (12,1-25,9) y 11,7% (5,8-17,5) para el grupo de MACS y Control respectivamente. Ocurrieron 5 abortos espontáneos en el grupo MACS y 7 en el grupo Control. La tasa de embarazo evolutivo fue 15,9% (9,4-22,3) y 5,4% (1,3-9,5).
2.2.2. ICSI con donación de ovocitos Tabla 5: Resultados detallados pertenecientes a los parámetros morfológicos embrionarios.
Tabla 6: Destino de los embriones viables en ambos grupos.
Tabla 7: Resultados clínicos de acuerdo a la intervención y a la intención de tratar.
2.3. Estudio de calidad morfocinética embrionaria mediante TMS Figura 4: Tasas de implantación en grupo MACS y grupo Control.
Tabla 8: Parámetros morfocinéticos.
3) MACS y RNV Tabla 9: Características neonatales.
Conclusiones - La separación inmunomagnética no afecta a la integridad o viabilidad de los espermatozoides aunque se ha visto un ligero descenso en la movilidad espemática.
- A pesar de que existe una tendencia al aumento de la oxidación y fragmentación del ADN debido al aumento de lavados y centrifugaciones, se ha visto que son independientes del grado de apoptosis y no están relacionadas con las posibilidades de embarazo.
- MACS tiende a aumentar ligeramente la calidad embrionaria y muestra datos comparables en términos de fecundación e implantación.
- MACS no parece afectar a la morfocinética embrionaria, ya que los variables morfocinéticas más relevantes fueron comparables, dando tasas de implantación similares en ambos grupos.
- La tasa de embarazo y RNV es levemente menor en el grupo de MACS cuando realizamos ICSI tras su comparación con el control, aunque sin relevancia clínica, mientras que en las IAS estas tasas muestran aumentos significativos en los resultados cuando el MACS se aplica.
- Nuestros resultados obstétricos y perinatales sugieren que la tecnología del MACS no parece crear ningún efecto adverso en los niños tras la aplicación su aplicación clínica, siendo necesario un amplio estudio randomizado con mayor tamaño muestral de RNV con MACS.
- Aunque la tecnología del MACS sea una tecnología eficiente, los resultados obtenidos son comparables con con las preparaciones estándar de selección que se emplean en nuestro laboratorio.
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