Resumen de Involvement of cathepsin-sirtuin1 new axis on the modulation of hepatic inflammation
Tanto LPS como TNF ejercen su función inflamatoria a través de la activación y traslocación de NF¿B al núcleo, concretamente del heterodímero p65/p50 (RelA/NFKB1). Una vez NF¿B se encuentra en el núcleo, se acetila para permitir la transcripción de genes NF¿B dependientes. En las células estrelladas hepáticas, estos genes coinciden con genes inflamatorios como MCP1, IL6, IL1ß; si bien en otros tipos celulares parenquimales (hepatocitos) pueden inducirse otros genes no inflamatorios tales como A20 eIL8.
En el núcleo, se encuentra la deacetilasa SIRT1 que se encarga de deacetilar a p65 induciendo su exportación al citosol mediada por IKK, lo que conlleva a la consecuente regulación negativa de genes NF¿B dependientes.
Las catepsinas pese a ser enzimas proteolíticas lisosomales/endosomales implicadas en una gran variedad de procesos fisiológicos; también tienen actividad nuclear. Diferentes catepsinas, como la CtsB y la CtsS tienen afinidad por SIRT1, cortándola e inactivándola. Es por ello, que el uso de inhibidores de CtsB/S modulara la transcripción de genes inflamatorios en las células estrelladas hepáticas, así como otros genes NF¿B dependientes de otras líneas celulares como hepatocitos y Hep3B.
La ampliación de estos resultados a las células de Kupffer y la línea de macrófago RAW 264.7, que son altamente inflamatorias, nos permite corroborar la funcionalidad de los inhibidores de CtsB/S en la modulación de la inflamación consensuada por una disminución de los genes NF¿B dependientes.
Al realizar estudios in vivo, tratando ratones C57Bl/6 con LPS obtenemos resultados similares; si bien en estas condiciones las células estrelladas hepáticas se encuentran todavía en estado quiescente. En este sentido, cabe recalcar que al estudiar la expresión de SIRT1 en células estrelladas hepáticas primarias de ratón, comparando con ¿-actina de músculo liso (¿-SMA, marcador de activación de las células estrelladas hepáticas), observamos como la SIRT1 aumenta durante la activación de las células estrelladas hepáticas, de forma paralela a ¿-SMA. Estos resultados in vivo nos llevan a pensar que otras células hepáticas no parenquimales encargadas de modular la respuesta inflamatoria NF¿B-dependiente; como los macrófagos, son las principales responsables del efecto sobre la inflamación observado in vivo, y que por lo tanto la modulación de SIRT1 por catepsinas es un sistema regulatorio más generalizado que tiene lugar en tipos celulares tan diversos como CEHs. De este modo, el empleo de liposomas con clodronato (CD) en estudios in vivo (donde las células de Kupffer son eliminadas), muestran una inducción de genes inflamatorios inferior tras un estímulo con LPS si lo comparamos con los ratones tratados con liposomas control-PBS (Fig1. Anexo).
El estudio de la ruta inflamatoria tras un estímulo de LPS en ratones con fibrosis tóxica inducida por CCl4 (mucho más susceptibles a la inducción de genes inflamatorios), nos indica la importancia de esta nueva ruta SIRT1-CtsB/S; ya que incluso ante una sobreexpresión de la transcripción de genes NF¿B dependientes, los inhibidores de CtsB/S reducen significativamente la evolución de la inflamación.
Por otra parte, dado que las NKT también están asociadas con las primeras respuestas inflamatorias y han mostrado una influencia crucial en un variado ámbito de respuestas inmunes e inflamatorias, decidimos evaluar la posible modulación de su activación por las catepsinas.
Durante la estancia en La Jolla Institute for Allergy and Immunology, observamos como la inhibición de CtsB/S conlleva a una reducción en la activación de las NKT; concretamente las invariant NKT (NKTi). Las NKTi son activadas tras inyectar a los ratones ¿-GC. Sin embargo, aquellos animales que habían sido tratados con los inhibidores, no tan solo mostraban una población menor de NKTi por citometría de flujo, sino que la producción de citoquinas como IL-4 e IFN¿ estaba bloqueada.
La inhibición de CtsB/S conlleva a una reducción de los niveles de NPC2 en las APC, lo cual podría indicar que la carencia de esta proteína impediría que se cargasen correctamente los lípidos que serían presentados por CD1d.
Los estudios in vitro, donde solamente tenemos APC y NKTi, nos muestran como los niveles de IFN¿ se ven reducidos con el uso del inhibidor Z-FL mientras se cargan las APC con ¿GC; lo cual nos lleva a pensar que la CtsS juega un papel crucial en el correcto ensamblaje de antígenos lipídicos a CD1d. Si bien, si aplicamos los inhibidores de CtsB/S en el momento del co-cultivo, donde la carga de ¿GC a las APC no se ha visto afectada por los inhibidores, los niveles de IFN¿ se ven bloqueados por ambos inhibidores.
Esto nos lleva a pensar, que las catepsinas juegan un doble papel en la activación de las NKTi, así como en la consecuente regulación de la inflamación mediada por estas células. Por un lado, actuando en los lisosomas permitiendo una correcta presentación de antígeno por las APC. Y por otro lado, su presencia en las NKTi conlleva a favorecer la transcripción de genes NF¿B dependientes, como IL-4 e IFN¿.
En conjunto, nuestros estudios revelan una nueva ruta de control de la inflamación mediada por el eje catepsina-SIRT1 que no había sido descrita hasta el momento y que es de expresión global, al menos en los tres tipos celulares hepáticos analizados. Esta nueva ruta ofrece una diana terapéutica antiinflamatoria novedosa en hígado, y posiblemente sea extrapolable a otras poblaciones celulares en otros tejidos.
