Development of new methods for the differentiatíon of hpscs for huntíngton's disease
- Autores: Andreas Mezger
- Directores de la Tesis: Josep Maria Canals Coll (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Nicholas Allen (presid.), Raquel Martín Ibáñez (secret.), Joaquím Egea Navarro (voc.)
- Materias:
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- Resumen
A pesar de que la primera descripción de un paciente con lo que ahora se denomina corea de Huntington se remonta a 1842 y la causa genética de esta enfermedad se conoce desde hace ya más de dos décadas, los mecanismos moleculares que dan lugar a una pérdida selectiva de las neuronas espinosas medianas están aún lejos de comprenderse completamente. La investigación enfocada a prevenir la muerte celular de las neuronas espinosas medianas se ha visto obstaculizada mayoritariamente por el hecho que la huntingtina mutante, la proteína responsable de la enfermedad, se expresa de forma ubicua en todo el cuerpo, lo que hace difícil la determinación de su influencia en la muerte celular selectiva de este tipo de neuronas. Debido a esta muerte selectiva, el uso de injertos alogénicos de células estriatales, destinado a reemplazar las neuronas perdidas, se ha presentado como una posible solución para mejorar los síntomas o incluso curar la enfermedad. Por este motivo, desde la primera obtención de células madre embrionarias y células madre pluripotentes inducidas humanas, varios grupos se han centrado en la diferenciación de estas células hacia neuronas espinosas medianas ya que podrían proporcionar una fuente ilimitada de células que podrían ser utilizadas para ensayos con fármacos, estudios de desarrollo o para terapia de reemplazo celular.
Sin embargo, a pesar de las claras ventajas de esta fuente de células, varios problemas complican sus aplicaciones clínicas: las diferencias entre las líneas celulares, la baja tasa de adhesión y supervivencia en la adaptación a otros sistemas de cultivo así como su efecto a nivel genético que aún se desconoce pero podría agravar la reproducibilidad de los protocolos existentes, que por el momento sólo producen poblaciones heterogéneas de neuronas. Por otra parte, el grave riesgo de que queden algunas células madre pluripotentes no diferenciadas entre sus derivados diferenciados con la capacidad de formar teratomas malignos después del trasplante sigue siendo un problema sin resolver.
Para superar los obstáculos mencionados anteriormente, es esencial estudiar las causas de las diferencias entre líneas celulares y condiciones de cultivo. Además, un mejor conocimiento del desarrollo estriatal proporcionará pistas sobre cómo mejorar la diferenciación de las células madres, ya sea por la modulación de las vías involucradas en el correcto desarollo o la sobreexpresión de factores de transcripción específicos del cuerpo estriado. Por otro lado el estudio de los diferentes progenitores neurales que dan lugar a diferentes áreas del cerebro permitirá la generación de herramientas para seleccionar progenitores específicos del cuerpo estriado durante la diferenciación, produciendo de este modo, mediante la eliminación de células madre o progenitores contaminantes de otras áreas del cerebro, una población pura de neuronas espinosas medianas que potencialmente podrían ser utilizados para aplicaciones clínicas.
Se han descrito varios factores de transcripción implicados en la generación de neuronas espinosas medianas. Entre ellos, dos miembros de la familia de transcripción Ikaros; Ikaros (IK1) y Helios (IKZF2), están implicados en el desarrollo estriatal. En este trabajo, nos centramos en la función de IK1, que juega un papel importante en la especificación correcta de las neuronas espinosas medianas, que queda demostrado por la reducción del volumen del estriado en animales KO para Ik1. Hemos demostrado que los precursores neurales positivos para DLX empiezan a expresar IK1, lo que les confiere identidad de neurona espinosa mediana ya que inician la expresión de DARPP32 y CTIP2. En el KO de Ik1, estos progenitores siguen proliferando, inhibiendo la generación de neuronas y oligodendrocitos, y debido a la ausencia de este factor de transcripción, se convierten en astrocitos corticales, lo que explica el aumento de astrocitos descrito en animales KO para Ik1. Además demostramos que el linaje IK1 da lugar a interneuronas positivas para CHAT y para CR, hecho que abre la posibilidad de que la zona subventricular de la eminencia lateral ganglionar pueda ser una fuente de interneuronas estriatales.
Para entender los mecanismos moleculares que causan las diferencias entre las líneas celulares y la adaptación a diferentes sistemas de cultivo, comparamos el perfil de expresión génica de tres líneas de células madre embrionarias por microarray. Estos estudios revelaron que las diferencias observadas entre las líneas celulares son probablemente debidos a la expresión diferencial de dedos de zinc y ARNs no codificantes importantes en la regulación de la expresión génica, ya sea por unión directa a sus respectivos promotores o por la regulación del estado epigenético del genoma a través de la asociación con enzimas de remodelación de la cromatina. Nuestros resultados sugieren que las diferencias epigenéticas entre líneas de células madre pueden causar la expresión diferencial de genes clave implicados en pluripotencia y diferenciación y por lo tanto juegan un papel importante en las diferencias dependientes de la línea celular descritas. Por otra parte, presentamos evidencias de que el sistema de cultivo tiene una influencia importante en el patrón de expresión génica y que estos cambios podrían ser, a parte de las diferencias entre las líneas celulares, otro factor importante que agrava la reproducibilidad de los protocolos de diferenciación. Nuestros resultados sugieren que la transferencia de un sistema de cultivo dependiente de fibroblastos a uno libre de fibroblastos (Matrigel) causa un cambio de expresión en los genes implicados en la adhesión y la comunicación entre las células que muy probablemente refleja la adaptación de un sistema de cultivo complejo a un sistema de cultivo más definido. Por otra parte, estos cambios causan posiblemente la regulación al alza de la señalización WNT, que tiene un papel importante en la decisión temprana del destino celular. Altos niveles de señalización de WNT inducen las células madre embrionarias hacia un fenotipo mesodérmico o endodérmico mientras que bajos niveles de señalización favorecen la diferenciación hacia un fenotipo neuroectodérmico.
Además pudimos demostrar que la inhibición de ROCK, que es ampliamente utilizada para mejorar la supervivencia y adhesión de las células madre embrionarias humanas, aumenta la adhesión durante la adaptación sin afectar la pluripotencia o proliferación, probablemente actuando sobre la organización del citoesqueleto. Estos cambios en el citoesqueleto sin embargo podrían ser responsables de un aumento en la muerte celular, así como de la regulación a la baja de la señalización de WNT. En resumen, los resultados obtenidos sugieren que la adaptación a un sistema de cultivo sin fibroblastos induce las células madre pluripotentes humanas hacia un fenotipo endodérmico o mesodérmico mientras que la adición de un inhibidor de ROCK induce las células hacia un destino neuroectodérmico.
Por último, hemos desarrollado un protocolo de diferenciación neuronal en monocapa que utiliza inhibidores de Activina/Nodal y señalización de BMP para inducir eficientemente diferenciación neuronal i hemos demostrado que dosis determinadas aumentan el número de precursores neurales específicos de prosencéfalo. Con el uso de este protocolo, se han generaro métodos para seleccionar progenitores neuronales de la eminencia ganglionar lateral positivos para DLX que pueden ser replaqueados y terminalmente diferenciados a neuronas maduras, eliminando así cualquier célula madre restante o progenitores específicos que no sean neuronas espinosas medianas. Ya que nuestros datos in vivo sugieren que los progenitores positivos para DLX de la eminencia ganglionar lateral expresarán IK1 y se convertirán en neuronas espinosas medianas, en este trabajo presentamos un ejemplo de cómo los estudios in vivo en ratones pueden traducirse correctamente en protocolos de diferenciación de células madre pluripotentes humanas capaces de producir poblaciones puras de neuronas espinosas medianas que podrían ser utilizadas para terapia de reemplazo celular o ensayos con fármacos.
