Resumen de Human papillomavirus dna prevalence and type-specific distribution in invasive cancers of the cervix, vulva, vagina, anus, penis and head-neck
Introducció La infecció pel virus del papil-loma humà (VPH), és causa necessària del càncer de cèrvix i també està associada causalment amb diferents fraccions atribuïbles a altres càncers com els d’anus, vagina, vulva, penis i del cap i coll, principalment els d’orofaringe. S’han reportat més de 150 tipus del VPH i es classifiquen en diferents grups en funció de la seva associació amb el càncer de cèrvix (tipus d’alt risc com els VPHs 16/18, entre d’altres; i altres tipus de baix risc com els VPHs 6/11). El descobriment de l’associació d’un número limitat de tipus virals amb diferents càncers ha suposat una revolució en el panorama de la prevenció de la patologia cancerosa associada al VPH. Aquesta revolució s’ha articulat principalment en desenvolupar mesures de prevenció primària i secundària amb fonaments basats en el virus. Aquestes mesures son les vacunes i l’ús de la detecció viral en el cribratge de càncer de cèrvix, respectivament. En aquest context, és d'especial interès conèixer amb la màxima precisió possible quina és la proporció de càncers associats al VPH així com els tipus implicats en els mateixos. Aquesta informació és clau per a ajudar al disseny tant de noves vacunes polivalents com de proves de detecció viral per a ésser utilitzades en el cribratge del càncer de cèrvix i altres càncers associats al VPH. Tanmateix, és una informació crucial per a avaluar el impacte de mesures preventives com les vacunes. En determinar la prevalença i distribució de tipus del virus abans de la implementació de les vacunes obtindrem una estimació basal que ens permetrà planificar la introducció de la mesura preventiva en la població i estimar el impacte que tindrà la seva introducció. El projecte vinculat a la tesi ha aconseguit establir una xarxa de col-laboradors a nivell internacional i crear un repositori amb un número important de mostres dels diferents càncers associats al virus, inclosos els més rars i en moltes ocasions de zones geogràfiques amb informació limitada, amb la finalitat d’obtenir informació basal imprescindible en la planificació del desenvolupament i implementació de mesures preventives dels càncers anogenitals i del cap i coll.
Els objectius de la tesi son:
1) Determinar la distribució de tipus del VPH en càncers de cèrvix i explorar la seva variació segons l'any de diagnòstic, regió geogràfica, edat al diagnòstic i histologia.
2) Explorar diferències en la via carcinogènica dels tipus del VPH d'alt risc i els de probable/possible alt risc en càncers de cèrvix, mitjançant la detecció d'ARNm E6*I i l'avaluació de l'expressió de proteïnes cel-lulars (pRb, p16INK4a, p53 i Ciclina D1).
3) Determinar la prevalença d'ADN del VPH i distribució de tipus càncers i lesions pre-neoplàsiques d’alt grau de l’anus, vagina, vulva i penis, i càncers de cap i coll. Determinar aquestes estimacions de manera global i per a les principals variables recollides com son la regió geogràfica, sexe, any de diagnòstic, edat al diagnòstic i histologia.
4) Avaluar la proporció de positivitat, en els casos VPH ADN positius, de marcadors d’activitat viral com son la detecció de ARNm d’oncogens virals, o immunomarcadors d’expressió de proteïnes cel-lulars (com el p16INK4a) en càncers de vulva, vagina, anus, penis, i del cap i coll.
Els materials i mètodes emprats es resumeixen breument a continuació. Primer es va crear una xarxa de col-laboradors a nivell internacional d’unitats clíniques i departaments d’anatomia patològica de diferents hospitals. Aquests centres sota un protocol estandarditzat varen seleccionar de forma consecutiva i enviar al Institut Català d’Oncologia sèries de mostres de teixits cancerosos conservats en parafina. Les mostres incloses son càncers primaris del cèrvix, vulva, vagina, anus, penis i del cap i coll; i lesions pre-neoplàsiques d’alt grau de vulva, vagina, anus i penis. Aquestes mostres varen ser processades seguint estrictes controls de qualitat per a evitar contaminacions. Es varen realitzar una sèrie de talls, el primer i últim es varen tenyir amb hematoxilina-eosina i les làmines generades varen ser avaluades per un panell de patòlegs seguint un algoritme definit i consensuat, utilitzant els paràmetres descrits als llibres de patologia de l’Organització Mundial de la Salut. Les seccions de teixit intermèdies varen utilitzar-se per a la detecció d’ADN viral, ARNm d’oncogens virals, i per a realitzar immunohistoquímiques per a avaluar patrons d’expressió de proteïnes cel-lulars com la p16INK4a. La tècnica utilitzada per a detectar ADN viral va ser el sistema SPF10/DEIA/LiPA25 (versió 1), i per al ARNm es va utilitzar PCR tipus específiques amb detecció mitjançant Luminex. Es varen realitzar controls de qualitat tant de l’ADN de la mostra com de l’ARN. Les principals anàlisi estadístiques emprades varen ésser l’estimació de proporcions amb els seus corresponents intervals de confiança al 95%, anàlisi de factors associats a la positivitat mitjançant models de regressió logística no condicionats o de Poisson, i anàlisi de la concordança entre marcadors mitjançant proporció de casos concordants, índex kappa i test de McNemar per a avaluar la distribució de discordants. La significació estadística es va establir a 0,05.
El total de mostres finalment incloses i en les que es va fer la determinació d’ADN viral varen ser: 10.575 de càncer de cèrvix, 496 d’anus, 408 de vagina, 1.709 de vulva, 1.010 de penis, 1.264 de cavitat oral, 1.090 d’orofaringe, 284 d’altres localitzacions de la faringe i 1.042 de laringe. En quant a les lesions pre-neoplàsiques d’alt grau, el número total de mostres reclutades i finalment analitzades varen ser 43 d’anus, 189 de vagina, 587 de vulva i 85 de penis. Les mostres varen ser majoritàriament procedents de països d’Europa i Llatino-Amèrica, i d’anys més recents. L’edat mitjana en les lesions canceroses va ésser més jove en els casos de cérvix-51 anys comparat amb la resta d’anogenitals i càncers de cap i coll, en els quals la mitjana sobrepassava els 60 anys en tots els casos, excepte per als càncers de faringe diferents a l’orofaringe. L’edat mitjana de les lesions precanceroses d’alt grau va ser d’uns deu anys aproximadament menors que les corresponents invasives. Els casos en la seva immensa majoria varen ser carcinomes escamosos.
Els principals resultats i conclusions de l’estudi es resumeixen a continuació: Les deteccions d’ADN del VPH més elevades es varen trobar en el càncer de cèrvix i anal, 85% i 88%, respectivament. La infecció per VPH en anus probablement és causa necessària del càncer així com ho és pel càncer de cèrvix. En el càncer de vagina vàrem detectar VPH en el 76% dels casos. Finalment, en el càncer de vulva, penis i del cap i coll les deteccions varen ser menors, responent al l’existència de més d’un factor etiològic en aquestes entitats (29%-vulva, 33%-penis, 7%-cavitat oral, 25%-orofaringe, 9%-altres càncer de faringe, i 6%-en càncer de laringe). És important destacar la baixa detecció viral que hem trobat en el càncer de cavitat oral i laringe en comparació a estudis previs. En les lesions pre-neoplàsiques d’alt grau de la regió d’anus, vagina, vulva i penis vàrem identificar una alta proporció d’ADN viral. La positivitat al virus va estar associada no tan sols a la localització anatòmica sinó dintre de cada localització a: a) la regió geogràfica, b) l’any de diagnòstic amb major detecció en anys més recents, c) l’edat al diagnòstic amb major detecció en casos joves excepte en el penis i cavitat oral, d) el sexe amb major positivitat en dones en l’orofaringe i laringe, i finalment, e) a la histologia, essent el diagnòstic histològic escamós de tipus warty-basaloid el que va presentar les majors proporcions de positivitat al virus. És important remarcar que tenint en compte la variació de prevalences segons aquestes variables, el fet d’agafar una dada global com a estimador únic de la prevalença del virus en certes localitzacions anatòmiques probablement no seria el més adequat i probablement s’haurien de donar els estimadors estratificats per exemple per àrea geogràfica. Això sobretot seria més notable en els càncers en els que el virus no és causa necessària, ja que la variabilitat geogràfica de la prevalença d’altres factors de risc i d’exposició al virus pot resultar en variacions importants en la detecció viral.
La contribució relativa dels VPHs 16 i 18 entre els càncers de cèrvix ADN positius va ser elevada i estable al llarg del temps. Van ser els dos tipus virals més freqüentment detectats al llarg de totes les dècades avaluades, sense variacions significatives del 1940 a 2007 (VPH16-de 61.5 a 62.1%, i VPH18-de 6.9 a 7.2%). Tampoc es varen detectar variacions estadísticament significatives dels altres tipus virals al llarg del temps avaluat. En l’anàlisi estratificat per les diferents variables disponibles, tan sols es va observar un increment al llarg de les dècades estudiades de la contribució del VPH16 en els adenocarcinomes. Una observació interessant va ésser que els casos associats als tipus 16, 18, i 45, es varen presentar a edats més joves que la resta de tipus en totes les dècades avaluades. Van haver-hi variacions petites en la distribució dels tipus més freqüents entre regions geogràfiques, i en relació a la histologia, es varen observar diferències en la distribució de tipus i freqüència, per exemple, en els adenocarcinomes només tres tipus virals, els VPHs 16, 18 i 45 es varen detectar en el 94% dels casos VPH ADN positius. Amb aquestes observacions s’espera un alt i estable impacte de la introducció de les vacunes contra el VPH en la reducció de la càrrega dels càncers de cèrvix en les cohorts vacunades.
En quant a les altres localitzacions anatòmiques i lesions més enllà del càncer de cèrvix, el tipus VPH16 va ser també el més freqüentment detectat. El virus 16 va ésser detectat en major freqüència en els càncers anals, vulvars, de penis, cavitat oral i orofaringe en comparació amb els de cèrvix, vagina i laringe. Aquesta troballa podria indicar una afinitat dels virus per als teixits diferent segons les diferents regions anatòmiques o respostes immunològiques diferencials.
La gran contribució dels tipus vacunals en els diferents càncers avaluats, principalment degut a l’alta contribució del VPH16, reforça el potencial impacte de las vacunes actualment disponibles en la prevenció de les lesions canceroses relacionades amb el VPH. Com exemple, segons les dades del projecte la nova vacuna contra el VPH de 9-valències podria prevenir entre un 80% i un 95% de les lesions canceroses invasives, depenent de la regió anatòmica.
A més hem pogut avaluar quina és la implicació en el procés oncogènic dels tipus detectats a nivell d’ADN. En el càncer de cèrvix hem comprovat que els tipus virals de probable i possible alt risc es comporten com els d’alt risc en quant a la detecció d’ARNm dels oncogens i la sobre-expressió de p16INK4a. Tanmateix, hem pogut comprovar que una gran majoria de casos de càncers invasors anogenitals i d’orofaringe en els quals hem detectat ADN viral de tipus d’alt risc, a més son positius per a marcadors d’activitat viral com son la detecció de transcrits d’oncogens virals (ARNm) o la detecció de patrons de proteïnes cel-lulars compatibles amb un perfil d’activitat cel-lular transformadora associada al VPH (com sobre-expressió de p16INK4a). Fet que suggereix que per estudis epidemiològics, la determinació d’ADN viral seria suficient sense incórrer en una gran sobre-estimació de les fraccions atribuïbles al virus per potencials contaminacions. Aquest model no estaria tan clar per als càncers de cavitat oral, laringe i càncers de la faringe excloent l’orofaringe, en els que la proporció de casos en els que es detecta l’ADN viral de tipus d’alt risc sense detecció d’altres marcadors d’activitat viral posaria en dubte l’ús de només l’ADN viral com a eina de determinació de fraccions etològiques atribuïdes al VPH.
Finalment, cal remarcar que el projecte ha generat un gran repositori de mostres de lesions canceroses associades al VPH que ha permès i permetrà resoldre altres preguntes de caire epidemiològic i mol-lecular encara no resoltes, més enllà dels objectius principals. Les dimensions i la informació ja disponible en quant a la detecció del VPH en les mostres, fan d’aquest repositori una base de gran vàlua per a futurs projectes.
