Modulation of emergent cortical activity and perturbational complexity index by electromagnetic fields

• Autores: Mattia D'andola
• Directores de la Tesis: Maria Victoria Sanchez Vives (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2016
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Alain Destexhe (presid.), Antonio Oliviero (secret.), Albert Compte Braquets (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad de Barcelona
• Materias:
  • Ciencias médicas
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• Resumen

  • INTRODUCCIÓN La actividad de onda lenta (Slow Oscillations, SO) es un sello distintivo del sueño No-REM (NREM) que se caracteriza por la alternancia entre estados activos (Up states) y silentes (Down states), a una frecuencia < 1Hz (Steriade 1993b). La actividad neuronal reclutada durante estados Up muestra características y una estructura funcional similar a la actividad presente durante el estado de vigilia (sincronización de actividad beta y gamma). Las SO pueden ser generadas en rodajas corticales in vitro en ausencia de tratamiento farmacológico (Sanchez-Vives and McCormick, 2000; Compte 2008) y, ya sean de origen neocortical o hipocampal, han sido empleadas para estudiar la influencia de los campos eléctricos uniformes en las redes neuronales, dada la accesibilidad y el tamaño reducido de la red implicada (Bawin 1984; Turner and Richardson, 1991). En particular, estudios recientes han demostrado los efectos de los campos eléctricos débiles (<10V/m) en la modulación de la tasa de disparo de las neuronas de una forma dependiente de la frecuencia (Reato 2010), y se ha demostrado que los campos despolarizantes en DC (Direct Current) tienen un impacto en el dominio temporal de las SO (Frolich and McCormick, 2010). El estudio de los efectos de dicho tipo de estimulación cortical adquiere mucha importancia ya que poco se sabe sobre los mecanismos celulares y de red subyacentes a los cambios en la actividad neuronal que produce, si bien la tDCS (transcranial Direct Current Stimulation) se ha demostrado efectiva en el ámbito clínico (Priori, 1998; Nitsche 2008; Nitsche 2009; Goder 2013). Uno de los principales objetivos de este doctorado ha sido investigar la acción de los campos DC en redes corticales que generan SO de manera espontanea. Esto ha permitido un uso más especifico de la estimulación, como por ejemplo para invertir los cambios inducidos por la farmacología, o también para la modulación en tiempo real de la actividad espontanea hacia un target especifico mediante el uso de un sistema closed-loop.

    A pesar de que durante el sueño de onda lenta la corteza al completo muestra el mismo patrón de actividad a una frecuencia similar, hipotetizamos que dicha actividad es dominada por mecanismos locales, en el sentido que pequeñas redes oscilando a estas frecuencias en particular dependen principalmente de inputs locales y no de inputs provenientes de áreas mas alejadas. En efecto, ha sido propuesto que las SO representan la actividad cortical "por defecto", pues son dominantes durante periodos de desconexión funcional o anatómica -que impide la entrada de otros inputs-, y en estados de ausencia de influencias neuromodulatorias ascendentes activadoras (Sanchez-Vives and Mattia, 2014). De hecho, la pérdida de consciencia durante NREM se ha relacionado con la dinámica biestable intrínseca típica de las SO (Pigorini 2015). Todo lo anterior apoya la teoría de que la consciencia requiere un balance óptimo entre integración funcional y diferenciación funcional en las redes tálamo-corticales, lo que se conoce como complejidad cerebral (Tononi and Edelman, 1998). Esta teoría, llamada IITC (Integrated Information Theory of Consciousness), propone que un sistema físico debería ser capaz de generar consciencia en la medida en que pueda discriminar entre un gran número de estados posibles (diferenciación) y que pueda hacerlo como un conjunto (integración). Varias metodologías han sido propuestas para estimar la complejidad cerebral, la mayoría basadas en el análisis de la actividad espontanea en términos de entropía e información mutua (Tononi, 1994), siendo aplicadas con éxito como medida de la consciencia en pacientes sanos despiertos y dormidos (Tononi and Edelman 1998; Seth 2006; Ferri 2007), durante sedación (Gili 2013, Monti 2013), en pacientes en estado comatoso, o con lesión cerebral que afecte el estado de consciencia (Achard 2012, Chennu 2014) . Sin embargo, la habilidad para integrar información solo puede ser demostrada desde una perspectiva causal (Massimini 2009), yendo más allá de la actividad espontanea. En primer lugar porqué el repertorio de estados disponibles de la red son solo potenciales por definición y, por tanto, no necesariamente observables, y en segundo lugar, porqué en general es muy difícil establecer si un sistema está integrado o no solo mediante el estudio de la actividad espontanea. Recientemente ha sido demostrado que estudiando la respuesta electroencefalográfica a la perturbación por TMS, es decir a un evento causal, se puede obtener una medida del nivel de la profundidad de la anestesia/coma/sueño (Casali et al 2013). Mediante el estudio de la dinámica espacio-temporal de la respuesta, se extrae un índice teórico del nivel de consciencia que es independiente al procesamiento sensorial (PCI- Perturbacional Complexity Index). Otro objetivo de esta tesis ha sido el estudio de la posibilidad de replicar el PCI en preparaciones corticales simples, simulando in vitro diferentes estados de la red mediante el empleo de fármacos, y variando el nivel de anestesia in vivo, con el fin de explorar posibles usos de la estimulación DC para afectar la complejidad neuronal.

    OBJETIVOS 1. Estudiar la modulación que ejercen los campos DC en la actividad espontanea de alta y baja frecuencia producida por redes corticales in vitro.

    2.Estudiar la modulación que ejercen los campos DC en la actividad de alta frecuencia (beta y gamma) inducida farmacológicamente en redes corticales in vitro.

    3.Diseñar, implementar y poner en funcionamiento un sistema closed-loop como demostración de la posibilidad de modular y eventualmente controlar las oscilaciones corticales.

    4. Evaluar la reproducibilidad del PCI in vitro, simulando diferentes estados cerebrales.

    5. Explorar el impacto de la modulación DC en la complejidad de la red cortical.

    6. Replicar los experimentos de respuesta a la perturbación in vivo, empleando animales profundamente anestesiados.

    RESULTADOS 1. Modulación DC de la actividad oscilatoria in vitro espontanea y aumentada farmacológicamente Se obtuvieron registros de Local Field Potential (LFP) en las capas infragranulares de rodajas neocorticales de hurón (corteza visual o prefrontal) durante SO espontaneas. Se aplicó estimulación DC de manera que el campo eléctrico estuviera alineado paralelamente al eje apical-dendrítico de las células piramidales corticales. Se emplearon diferentes intensidades de campo (hasta 6 V/m), incluyendo periodos de recuperación entre las secuencias de estimulación, y alternando campos hiper-polarizantes (negativos) y despolarizantes (positivos) para las neuronas piramidales (Jeffereys 1979, Bawin 1986). La intensidad de los campos eléctricos se vio limitada a un máximo de 6 V/m por razones electroquímicas.

    1a. Efectos de la estimulación DC en las ondas lentas La modulación de las SO se cuantificó por la estimación de diferentes parámetros, como la frecuencia de las oscilaciones, la duración de los estados Up/Down y la frecuencia de disparo tanto durante Up states como durante los Down states. Se observó que los campos positivos aumentaron la frecuencia de las SO, mientras que los campos negativos la disminuyeron. Esto se debió al acortamiento o al alargamiento de la duración, respectivamente, de los Down states, mientras que la duración de los Up states se mantuvo casi invariable. Este desacoplamiento de la dinámica entre Up states y Down states es notable, ya que por efecto de otro tipo de perturbaciones, como cambios en la inhibición (Sanchez-Vives et al 2010) o en la temperatura (Reig et al 2010), la duración de los Up states y Down states varió de manera dinámicamente relacionada. Se observó que la intensidad de este efecto variaba entre rodajas, variabilidad que hemos cuantificado a través de un Índice de Modulación (MI), definido como la pendiente de la regresión lineal del logaritmo de la duración de los Down states a diferentes intensidades del los campos eléctricos. Las diferencias en la capacidad de respuesta de las rodajas estaban relacionadas con la actividad oscilatoria inicial: de hecho se encontró una correlación lineal entre el MI y la duración inicial de los Up states y de los Down states. La frecuencia de disparo relativa durante los Up states permaneció invariable a pesar de la intensidad y de la polaridad de la estimulación, en contraste con la frecuencia de disparo absoluta, es decir, la potencia en el rango de frecuencias entre 200 y 1500 Hz, que varió junto con la intensidad de la estimulación tanto durante los Up states como durante los Down states. También la desviación estándar de la frecuencia de disparo relativa en los Down states fue modulada por la estimulación y se pudo correlacionar con la frecuencia de las SO.

    Todos estos resultados fueron reproducidos por la predicciones de un cell assembly model, diseñado en colaboración con el ISS en Roma, con el que se simularon los efectos de la aplicación de corriente externas sobre la red.

    1b. Efectos de la estimulación DC en las altas frecuencias A continuación cuantificamos si los campos eléctricos DC tenían efectos sobre las frecuencias en el rango beta (15-30 Hz) y gamma (30-90 Hz) que se generan por circuito cortical durante los Up states (Steriade 1996; Hasenstaub 2005; Compte 2008). En casi un tercio de las rodajas, el efecto más consistente fue una disminución de la potencia en estos rangos de frecuencia por efecto de campos negativos, de forma lineal con la intensidad de la estimulación. En cambio, campos positivos indujeron una potenciación de la sincronización de las altas frecuencias, con un efecto específico para los rangos beta y gamma. Por otro lado, los dos tercios restantes de la rodajas no presentaron ninguna regulación de la actividad a estas frecuencias, ya sea de potenciación o de disminución.

    La red local en rodajas corticales puede generar sincronización en beta y gamma durante los Up states en ausencia de cualquier neurotransmisor adicional u otras estimulaciones (Sanchez-Vives and McCormick 2000; Compte 2008), aunque la potencia en estos rangos es mayor en la corteza in situ (Ruiz-Mejias et al 2010; Hasenstaub et al 2005). Con el fin de incrementar la generación de actividad cortical en las frecuencias beta y gamma. en un segundo grupo de experimentos se aplicaron 0.2 µM de ácido kaínico en el baño (Cunningham et al 2003). Como resultado, la dinámica de los estados Up y Down desapareció, entrando la red en una condición de disparo continuo, con un aumento de potencia en general en las altas frecuencias y un pico especifico a los 30 Hz. De hecho, la estimulación con campos positivos no indujo ningún aumento adicional de actividad en las altas frecuencias, lo que sugiere que la red cortical aislada bajo la influencia del Kainato puede alcanzar un nivel de saturación debido a la capacidad de generar actividad en las altas frecuencias en ausencia de otros neurotransmisores. Por otro lado, la aplicación de campos negativos redujo progresivamente la actividad en beta y gamma, eliminó el pico emergente y disminuyó la potencia de todo el espectro, volviendo prácticamente a la condición inicial de control.

    2. Control closed-loop de la frecuencia de las oscilaciones corticales Con un mejor conocimiento de los mecanismos de la redes corticales en respuesta a la estimulación DC, y en colaboración con el ISS de Roma, hemos creado un sistema closed-loop para la estimulación DC in vitro. Esto se implementó como una prueba de concepto de la idea que las propiedades de las SO se pueden controlar en tiempo real. El sistema incluye un aislador de estímulo diseñado en conjunto con el ISS, que está controlado por un software específico escrito en Spike2. El objetivo era de conseguir un control en línea de los parámetros de actividad en respuesta a la estimulación. En particular, nuestro primer objetivo era modular la frecuencia de las SO hacia targets específicos. Como sabíamos que cada rodaja responde con diferente intensidad a la estimulación, el sistema fue configurado para comprobar, en una fase preliminar, cómo la frecuencia de las SO cambiaba con diferentes niveles de estimulación. Después se hacía rápidamente un fit de los resultados, de manera que para cada target de frecuencia se hacía una estimación inicial del nivel de corriente a aplicar. A esto le seguía una fase de ajuste fino en la cual lo cambios de corriente se regulaban con la distancia desde el target. Una vez alcanzado el objetivo, la frecuencia se mantenía durante un tiempo, y después el sistema pasaba al target siguiente. Los umbrales en tiempo y amplitud para detectar las transiciones entre Up y Down states se establecían automáticamente a partir de un canal virtual filtrado en línea, con características similares a la MUA. De todos modos, la intervención del usuario estaba permitida en cualquier momento.

    2a. Propiedades de estabilidad y flexibilidad del sistema y consistencia en la respuesta de red Como se ha dicho antes, hemos demostrado que diferentes redes responden de manera diferente a la misma estimulación DC, de manera muy dependiente de la actividad inicial. El closed-loop es un sistema ideal para mantener bajo control redes con un comportamiento tan heterogéneo. Independientemente de la frecuencia de las SO al principio, la combinación de estimación inicial de la corriente con la fase de ajustes finos permitía al sistema llevar las SO a la frecuencia deseada. En la primera parte de este trabajo de tesis se observó que la estimulación DC no produce efectos a largo plazo (Bikson 2001; Frolich and McCormick 2010), sin embargo en esta segunda parte se observaron diferencias entre repeticiones del mismo protocolo en algunas rodajas. Esta heterogeneidad podría estar relacionada con algún efecto de fatiga a corto plazo, la variabilidad intrínseca de la actividad en rodajas o algún otro efecto del entorno, como por ejemplo la oxidación de los electrodos o pequeños cambios inevitables en la temperatura o en el flujo de la solución. Sin embargo, el sistema closed-loop fue capaz de dirigir la actividad hacia el target deseado de todas formas. La detección automática en línea de los Up states supuso un gran desafío, y requirió reducir los artefactos debidos a los cambios en la corriente aplicada. Esto se logró con una combinación de elementos hardware y software. Sorprendentemente, estos breves artefactos parecieron no tener efecto sobre la actividad emergente de la red. Además de aumentar la calidad de la detección automática de los Up states, esto nos permitió observar breves periodos de adaptación de la red en los segundos inmediatamente posteriores a un salto grande de corriente, que no eran visibles en los experimentos anteriores en los que se utilizaban estimuladores comerciales.

    3. Estudio perturbacional de la complejidad en redes pequeñas 3a. Manipulación farmacológica de la actividad in vitro Para el estudio de la complejidad perturbacional en redes pequeñas, decidimos aprovechar el modelo in vitro. Se registró la actividad celular en rodajas coronales de la corteza visual de hurón, que genera espontáneamente SO. Los registros se obtuvieron utilizando una matriz de electrodos de 16 canales que cubre una longitud de 3 mm, por lo general registrando tanto en capas supragranulares como infragranulares. La perturbación de la actividad se logró a través de pulsos eléctricos (ES) aplicados en capas infragranulares, con parámetros empíricamente seleccionados sobre la base de experimentos preliminares. La respuesta a la estimulación se observó en 3 condiciones diferentes: 1) durante las oscilaciones lentas (SO); 2) en una condición en la cual se simulaba el sistema de activación neuromodulatorio - o "estado de alerta" - mediante la aplicación de 50 μM de Norepinefrina + 0.5μM de Carbachol en el baño (NE+CCh); 3) en una condición de excitabilidad aumentada de la red, obtenida por la aplicación en el baño de 0.2μM de kainato (Ka).

    Después de la aplicación de NE+CCh se observó que la biestabilidad espontanea Up-Down, propia de la condición SO, desapareció siendo sustituida por fluctuaciones rápidas y no regulares del LFP (Favero 2012; Castro-Alamancos and Gulati 2014). En particular, se observó un aumento en la frecuencia de disparo respecto a la condición de SO. Esto probablemente se debió al aumento de excitabilidad de las células piramidales por el bloqueo de canales de K+, acompañado por una reducción de excitabilidad en las interneuronas de disparo rápido (Favero et al 2012), mediada por receptores muscarinicos M1 (Schmidt et al 2013; Castro-Alamancos and Gulati 2014). Se observó un aumento aún mayor en la frecuencia de disparo después de la aplicación del kainato. De hecho, dicho compuesto es un agonista de los receptores glutamatérgicos bien conocido para inducir un aumento de la actividad de banda ancha in vitro (Cunningham et al 2003; Florez et al 2013), que surge de un aumento en la actividad de spiking asíncrona (Pincus and Goldberger 1994, Ray et al 2008; Miller 2010). Como medida de la irregularidad de los patrones, hemos calculado la Entropía Aproximada (Pincus and Goldberg 1994) de los patrones espontáneos de MUA. Esta medida resultó aumentada en promedio, de forma similar en todos los canales y registros en las condiciones NE+CCh y Ka.

    3b. Respuesta a la perturbación eléctrica, phase-locking y complejidad perturbacional Durante las SO, cada ES evocó una oscilación lenta (Timofeev et al 2000), con Up states y Down states que parecían similares a los espontáneos. El patrón evocado es reproducible entre los ensayos, y es evidente al hacer la media. Por lo tanto, y tal como se esperaba, la respuesta media provocada por ES reveló la biestabilidad intrínseca de la red in vitro durante las SO. En la condición NE+CCh la respuesta a la ES se caracterizó por una combinación prolongada de ondas, con una duración típica entre 1 y 2 segundos, dando lugar a una dinámica más compleja. Sorprendentemente, después de la aplicación de Ka la estimulación evocó un breve estado de silencio inicial seguido de una recuperación similar a la actividad pre-estímulo, a pesar de que el aumento en potencia fue mayor, y el aumento en entropía comparable, en relación a la condición NE+CCh. La estructura de la respuesta fue similar en todos los canales para cada rodaja. Para cuantificar el efecto determinista de la ES, hemos calculado el Phase-Locking Factor instantáneo (PLF) (Sinkkonen et al 1995, Pigorini et al 2015), definido como el valor absoluto de la transformada de Hilbert media de cada ensayo de estimulación. Luego se utilizó el promedio del tiempo máximo de significancia estadística del PLF entre canales, para comparar la duración del phase-locking entre rodajas. Durante las SO el PLF era típicamente significativo para el tiempo que cubría la duración del Up state evocado. Consistentemente se encontró una correlación lineal entre el tiempo de inicio del Down state en la respuesta y la caída del PLF en todos los canales y los registros. La duración de la correlación causal de la actividad con el estímulo (el tiempo de caída del PLF) se incrementó notablemente después de la aplicación de NE+CCh. En el caso de aplicación del Ka el phase-locking aumentó en menor medida, comparado con la condición NE+CCh.

    Luego se calculó el PCI con un procedimiento similar, y especialmente adaptado, al utilizado para los experimento de TMS/EEG en los seres humanos (Casali et al 2013). La complejidad de Lempel-Ziv se calculó a partir de matrices binarias que representaban la significancia estadística de la respuesta, y después normalizada por su entropía. Durante las SO, por lo general había muy pocos puntos significativos, excepto para el Up state evocado. El patrón de activaciones cambió dramáticamente con la aplicación de NE+CCh y las fluctuaciones de actividad sincronizadas resultaron significativas en muchos canales por un periodo más largo. En cambio, se encontró un escenario similar a las SO después de la aplicación de Ka: casi todos los puntos significativos se encontraron durante el estado silente. Estas diferencias fueron entonces adecuadamente cuantificadas por el PCI, que en la condición de NE+CCh resultó estadísticamente aumentado respecto a ambas condiciones, de SO y Ka, que reportaron valores similares de PCI. Por último, se determinó la evolución temporal de PCI en las diferentes condiciones. Durante las SO y bajo el efecto del Ka, el PCI alcanzó una meseta alrededor de 0.25s, tiempo comprable al que marca la aparición de el Down state y la caída del PLF, mientras que después de la aplicación de NE+CCh siguió creciendo hasta los 2s.

    3c. Efectos de la estimulación DC en la complejidad in vitro Como se ha explicado antes, la estimulación DC durante las SO a las intensidades que utilizamos produce un efecto principalmente en el nivel de polarización de la red, lo que hace que los Down states sean estados más o menos preferidos. Con esto como premisa, hemos comprobado los efectos de tales campos en la complejidad perturbacional de la red in vitro, esperando no observar cambios efectivos en la PCI como confirmación ulterior del papel de la biestabilidad. Para este estudio utilizamos registros en los que la perturbación se llevó a cabo mediante la aplicación de puffer de glutamato en lugar de ES. En el control, así como durante la estimulación DC tanto positiva como negativa, la perturbación evocó un Up state, siempre seguido por un Down state en el cual los niveles de MUA no eran distinguibles de la actividad pre-estímulo. Esta falta de modulación de la dinámica de la respuesta se reflejó naturalmente en el PCI, que no cambió significativamente con ninguna de las intensidades o direcciones de estimulación, de manera muy homogénea entre las rodajas.

    3d. Test de PCI in vivo Finalmente, probamos la aplicabilidad del algoritmo de PCI en los registros in vivo, para sentar las bases de estudios futuros. Ratas adultas fueron anestesiadas con isoflurano, se abrió una craneotomía del tamaño de un hemisferio y los electrodos de registro se colocaron en la superficie de la corteza, por lo general cubriendo las aéreas motora, premotora y somato-sensorial. Se aplicó entonces el mismo protocolo experimental de perturbación utilizado en los experimentos in vitro, variando el nivel de anestesia a través de modificaciones en el porcentaje de isoflurano suministrado, desde un mínimo del 1% (anestesia leve) hasta un máximo del 2% (anestesia profunda). La incidencia de Up state espontáneos desapareció progresivamente con la profundidad de la anestesia. En los niveles más profundos de anestesia cada ES provocaba siempre un ciclo de SO, que progresivamente se hizo más largo y complejo mientras que disminuía el porcentaje de isoflurano. A diferencia de lo que se observó in vitro, la dinámica de la respuesta en los niveles más leves de anestesia no mostró una modulación de fase muy consistente, probablemente debido al hecho de que, aunque el porcentaje de isofurano era bajo, el animal seguía anestesiado (ausencia de reflejo). De todas formas, se puede apreciar una tendencia a la sincronización de la actividad, pero no lo suficiente como para crear un aumento real del phase-locking. Por otro lado, el PCI captura adecuadamente estos cambios en la cantidad de actividad evocada, y disminuye al aumentar la profundidad de la anestesia.

    DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES 1. Modulación DC de la actividad in vitro Nuestros resultados confirman resultados previos obtenidos con configuraciones similares (Frohlich and McCormick 2010; Reato et al 2010) y aportan nueva información sobre la modulación tanto de bajas como de altas frecuencias de la actividad espontanea y alterada farmacológicamente. Campos positivos acortan los periodos silentes, posiblemente incrementado el gradiente del voltaje de membrana durante los Down states, llevando las células más cerca del umbral para la producción de un Up state. Tal aumento de la excitabilidad de las neuronas contribuiría a incrementar las fluctuaciones en la frecuencia de disparo de red, lo que resulta en un aumento de la probabilidad de producción de un Up state. Por otro lado, aplicando campos negativos se reduce el gradiente de voltaje de las membranas durante los Down state. A nivel de red esto se traduce en una menor amplitud y en la reducción de las fluctuaciones en la frecuencia de disparo, que a su vez disminuye la probabilidad de desencadenar Up states, ampliándose así la duración media de los Down states. Sorprendentemente, una vez iniciados, los Up states tenían siempre la misma duración media a pesar de la estimulación. Este efecto podría estar asociado al hecho de que el nivel de despolarización/hiperpolarización inducido por los campos eléctricos (0.5mV cada 1V/m - Frohlich and McCormick 2010) que hemos utilizados es muy pequeño, y es suficiente para modular la actividad durante los Down states. Los Up states en cambio son un fenómeno robusto de red, casi no modulable a estas intensidades, hecho que sugiere un fuerte mecanismo de autocontrol de la red, probablemente asociado con un balance de excitación e inhibición en estos estados. Además, los Up states son estados de alta conductancia (Reig 2015; Contreras et al 1996; Paré et al, 1998; Desteche and Paré 1999), en los cuales la resistencia de input de las neuronas se reduce de tres a cinco veces a causa de la actividad espontanea (Paré et al 1998; Destexhe and Paré 1999). Este aumento de la resistencia podría reducir aún más el efecto de campos DC en la membrana, lo que contribuiría a la falta de un efecto visible es estos estados. Tales mecanismos explicarían también la falta de modulación de la actividad en las altas frecuencias para la mayoría de las rodajas. No hemos podido encontrar ninguna correlación de la presencia/ausencia de modulación en beta y gamma con cualquiera de los parámetros que describen la actividad inicial de la red. Sin embargo, podemos especular con que probablemente las rodajas que mostraron modulación en las altas frecuencias tenían una excitabilidad inicial menor, lo que permite una alteración de la actividad emergente incluso a bajas intensidades de estimulación. De hecho, se observó un aumento específico en las frecuencias beta y gamma durante los Up states mediante la aplicación de campos despolarizantes, y una reducción inespecífica de la actividad en los mismos rangos durante la estimulación con campos hiperpolarizantes. Esto probablemente es signo de un efecto indirecto de la estimulación DC: un aumento de la frecuencia de disparo o de su sincronización temporal (Compte et al 2008), promovería la reverberación sináptica, en la cual se producen ritmos beta y gamma. Por otro lado, la estimulación negativa impediría a la red de alcanzar el estado de resonancia, con la consiguiente disminución de la actividad general. Tales mecanismos demostraron mantenerse y ser evidentes también en el caso de una actividad farmacológicamente aumentada. De hecho, la aplicación de kainato indujo una fuerte despolarización de la red (con picos emergentes en beta y gamma), que permitieron apreciar mejor el efecto de los campos negativos, capaces de disminuir la actividad de la red alterada hasta los niveles de la condición inicial de control. En el rango de frecuencias de la tasa de disparo, la actividad en los Up states fue modulada coherentemente entre las rodajas por los campos negativos, mientras que la estimulación positiva indujo un aumento solo en algunas rodajas. Aún así, en promedio estos efectos se compensaron por los observados en los Down states, resultando en una invariancia de la frecuencia de disparo relativa de la red.

    2. Modulación DC closed-loop para la regulación de la frecuencia de SO in vitro A pesar de la heterogeneidad de la respuesta en las altas frecuencias de las rodajas a la estimulación DC, la modulación de la actividad en las bajas frecuencias siguió un comportamiento lineal, por lo que se puede describir fácilmente por un modelo lineal simple. Entonces, el control closed-loop de los parámetros de las SO seria teóricamente fácil de diseñar, siendo al mismo tiempo de gran interés para aplicaciones posibles clínicas. Así, construimos un sistema capaz de modular la frecuencia de las SO, como primer acercamiento al problema. Para lograrlo tuvimos que resolver distintos problemas, desde la gestión de los artefactos y sus consecuencias, hasta los problemas relacionados con la ejecución de los experimentos. Nuestro sistema cae en la categoría de sistemas semi-automáticos, lo que significa que pueden trabajar solos, pero en caso de necesidad el usuario puede intervenir en línea. En la mayoría de los casos, el método para la configuración automática de los umbrales de identificación de los Up states ha funcionado bien, también gracias a los ajustes de hardware de la electrónica del estimulador, mientras que en algunos casos se ha necesitado la intervención del usuario para cambiar el umbral sin ninguna interrupción del protocolo. Al reducir el ruido producido por el hardware durante de las actualizaciones del nivel de corriente, junto con soluciones software, hemos sido capaces de reducir la aparición de artefactos de estimulación hasta obtener picos pequeños y cortos, fáciles de evitar en el análisis en línea. También se logró una reducción significativa de la saturación de la señal en respuesta a grandes cambios en el nivel de corriente, lo que ha permitido ilustrar como la red necesita un determinado tiempo para adaptarse al nivel de estimulación. Dado que los patrones rítmicos espontáneos emergentes son el resultado tanto de propiedades sinápticas (como excitación e inhibición) como intrínsecas (canales iónicos, propiedades de membrana) de las neuronas de la red, por cada nuevo nivel de excitabilidad la red necesita un periodo para encontrar un nuevo equilibrio en los diferentes mecanismos que después resulta en una frecuencia oscilatoria estable.

    La modulación de la frecuencia de las SO representa un punto de partida para un control closed-loop más completo de la actividad cortical. El interés sobre sistemas closed-loop queda ilustrado por las pruebas recientes en sistemas implantables para los seres humanos, pensados para mejorar la condición de los pacientes afectados por la enfermedad de Parkinson, o que sufren de crisis epilépticas (Sun and Morrel, 2014). La posibilidad de un sistema autónomo que controla y ajusta las SO durante el sueño del paciente podría ser una aplicación interesante de las futuras evoluciones de nuestro sistema, que llevaría a un uso más centrado del tratamiento tDCS.

    3- Enfoque perturbacional para la investigación de los mecanismos que regulan la complejidad de la red neuronal in vitro Como se ha mencionado, las SO son la marca de una biestabilidad intrínseca entre Up states y Down states de la red cortical (Compte et al 2003) y los canales de K+ son candidatos plausibles para controlar esta alternancia lenta (Sanchez-Vives and McCormick 2000; Timofeev et al 2000; Compte et al 2003; Cunningham et al 2006; Sanchez-Vives et al 2010). En particular, se cree que la iniciación de los Down states puede ser controlada principalmente por un feedback negativo lento debido a corrientes K+ dependientes de Na+. Tales mecanismos son mediados por la mismas conexiones intracorticales, como se demuestra por el hecho de que las SO pueden ser reproducidas in vitro (Sanchez-Vives and McCormick 2000), así como en animal decorticado (Timofeev 2000) sin añadir ningún tratamiento farmacológico. Nuestras observaciones apoyan que el Down state parece tener un papel específico en la disrupción precoz de la interacción causal. De hecho, la reanudación de la actividad después de el Down state ha demostrado ser un proceso estocástico (Sanchez-Vives and McCormick 2000; Compte et al 2003; Cossart et al 2003; Luczak et al 2003; Deco et al 2009; Chauvette et al 2011). En nuestros resultados, esto se sustenta en la ausencia de phase-locking en la respuesta a la perturbación que observamos durante las SO: el circuito cortical biestable, al recibir un input, tiende a responder brevemente y después a silenciarse y a volver a una actividad que es independiente del estímulo (Pigorini et al 2015). De hecho, el tiempo de caída del PLF correlaciona con el momento en el cual empieza el Down state. Estas observaciones se confirman por el comportamiento de la red en los otros dos escenarios en los que, mucho mas allá de las similitud de los espectros y de la entropía, el phase-locking se restauró solo en el caso en que se redujo la biestabilidad (es decir, después de la aplicación de NE+CCh). En el caso de aplicación de Ka, donde los canales de K+ permanecen abiertos, las interacciones deterministas no se recuperaron, aunque lo ritmos rápidos se incrementaron. Los cambios en las interacciones deterministas en los diferentes estados de la red fueron adecuadamente capturados por el PCI. La ventaja de un enfoque perturbacional surge aquí del hecho de que el PCI capta al mismo tiempo el contenido de información y la integración del output global de la red (Casali et al 2013). El incremento que se observó en el PCI al actuar farmacológicamente sobre los sistemas colinérgico y noradrenérgico es un signo de un aumento equilibrado entre el contenido de información, expresado por un aumento en los niveles de actividad a altas frecuencia y de entropía, y la integración funcional, expresada por el incremento en las interacciones deterministas entre los sitios de registro. Así, esto nos lleva a especular que las observaciones que hemos realizado in vitro podrían representar a micro-escala un comportamiento de la red que refleja las dinámicas que se muestran en la meso-escala (Pigorini et al 2015) y en la macro-escala (Casali et al, 2013), donde las diferencias en PLF y en PCI se asociaron a diferentes estados de conciencia. Por lo tanto, la preparación in vitro podría representar un buen modelo de lesión cortical en pacientes (Rosanova et al 2012).

    4. Efectos de la estimulación DC en la complejidad de la red La aplicación in vitro de estimulación DC durante del protocolo perturbacional ha facilitado nuevas evidencias del papel fundamental de la biestabilidad intrínseca de la red en la disrupción temprana de la complejidad y de la causalidad en la red cortical. Como se ha demostrado, a las intensidades que probamos, la estimulación DC afecta principalmente a la actividad durante los Down states, dejando la red en su estado biestable, donde Down states siguen ocurriendo aunque con frecuencia diferente. Así, la falta de modulación de PCI y PLF con estimulación DC confirma la necesidad de que la red salga de la dinámica biestable intrínseca para mostrar interacciones mas complejas. Sin embargo, estos resultados tienen potencial relevancia clínica, por ejemplo, como técnicas innovadoras para el tratamiento de los efectos en las áreas peri-lesionales después de un ictus cerebral. Estas áreas a menudo se caracterizan por la aparición de ondas lentas lateralizadas visibles en el EEG durante estado de alerta, y probablemente son el resultado de unas alteraciones funcionales a nivel local que interrumpen las interacciones de largo alcance entre las áreas cerebrales (Di Piero et al 1990; Dubovik et al 2012; Carrera and Tononi 2014). Una idea emergente es que estas ondas lentas patológicas podrían compartir el mismo mecanismo electrofisiológico básico de la SO durante el sueño NREM, y por lo tanto que la actividad en las regiones peri-lesionales se caracteriza por una biestabilidad intrínseca. Mientras que la lesiones anatómicas y las desconexiones son irreversibles, la biestabilidad sí que es una dinámica reversible. Por lo tanto, mediante la manipulación del equilibrio de excitación e inhibición local (por ejemplo con la estimulación DC), podría ser posible reducir la biestabilidad peri-lesional y mejorar la conectividad de la red, y por tanto su complejidad.

    5. Caracterización del PCI in vivo en diferentes estados de anestesia Los resultados del estudio perturbacional en animales anestesiados sugieren que la versión de PCI adaptada para los registros in vitro funciona también para registros in vivo. La inducción de la anestesia mediante isoflurano nos dio la posibilidad de modular el estado cerebral simplemente variando la dosis de anestésico en el flujo de oxígeno. De hecho, es conocido que el isoflurano inhibe la liberación de acetilcolina en la corteza (Damsma and Fibiger 1991; Shichino et al 1997) y en la formación reticular pontina (Keifer 1994) en ratas anestesiadas. Estudios en humanos demostraron que la reducción del metabolismo en regiones cerebrales inducida por isoflurano correlaciona con la densidad de receptores muscarínicos, lo que confirma la participación antagonista del sistema colinérgico en anestesia con isoflurano (Alkire and Haier 2001; Hudetz et al 003). Otra vez, nuestros resultados reflejan la conexión entre la pérdida de la capacidad de integración de la información, así como de la consciencia durante la anestesia general, con la biestabilidad intrínseca de la red cortical, eventualmente conectada con las corrientes K+ dependientes de la actividad. Los resultados observados en esta sección ponen entonces una base para futuros estudios sobre complejidad perturbacional in vivo, como por ejemplo sobre el uso de la estimulación DC para la recuperación de la funcionalidad en regiones peri-lesionales, eventualmente combinada con tratamiento farmacológico colinérgico basado en las observaciones in vitro.