Resumen de Estudio de la interacción celular con la matriz extracelular y su regulación en la fibrosis pulmonar idiopática: posibles vías para inhibir la progresión fibrogénica
Introducción: La Fibrosis Pulmonar Idiopática (FPI) es la neumopatía intersticial de etiología desconocida más frecuente, caracterizada por una alteración en la reparación tisular y fibrosis progresiva. Los pacientes con FPI fallecen a los 3-4 años del diagnóstico, sin un tratamiento curativo en la actualidad. Las proteínas de matriz extracelular (MEC) son un componente clave en el mantenimiento de la arquitectura y correcta reparación pulmonar después de cualquier daño en su tejido. Un desequilibrio entre estas proteínas de matriz podría desencadenar la progresión de las diferentes enfermedades pulmonares intersticiales difusas (EPID). No obstante, la expresión de las proteínas específicas que conforman la MEC fibrótica está todavía en discusión. A su vez, el microambiente extracelular de un tejido es fundamental para el crecimiento, proliferación y comportamiento celular.
Objetivo: La presente tesis doctoral tuvo como objetivo principal caracterizar mejor la MEC de pulmones con FPI y entender la relación de dicha matriz con las células que anidan en ella.
Metodología: Para ello, por una parte focalizamos nuestro estudio en las proteínas de matriz altamente sobreexpresadas en los pulmones fibróticos en comparación con pulmones normales y pulmones afectos de enfermedad intersticial inflamatoria, bajo la hipótesis que la diferencia proteica en MEC pudiera ser clave en el desarrollo y perpetuación del proceso fibrosante. Por otra parte, se diseñó un nuevo sistema de cultivo tridimensional basado en colágeno tipo I endurecido mediante glicación no-enzimática, que buscara mayor semblanza con las condiciones biofísicas reales del pulmón fibrótico y que permitiera posteriormente estudiar las interacciones entre los fibroblastos inmersos dentro de la matriz con el mismo colágeno y con las proteínas sintetizadas de novo.
Resultados: Los resultados obtenidos muestran como los pulmones de pacientes con FPI presentan un patrón glicoproteico definido de MEC que difiere de pulmones normales. Curiosamente, mientras que este patrón resulta significativamente diferente de la forma inflamatoria de neumonitis por hipersensibilidad (subaguda, NHsa), comparte algunas características proteicas con la forma fibrosante de la propia neumonitis por hipersensibilidad (crónica, NHc), lo que apuntaría a un posible papel de estas glicoproteínas en la fibrogénesis pulmonar. Concretamente, las proteínas de MEC que se hallaron sobreexpresadas fueron tenascina-C (TNC), versican (VCAN) y fibronectina (FN), colágeno tipo I y tipo III, y, de las solubles, las metaloproteasas (MMPs) 1, 2, 3, 7, 9, 12 y 13. En cuanto a las proteínas que se detectaron infraexpresadas en los pulmones fibróticos comparado con pulmones normales, fueron laminina, colágeno tipo IV y Tipo C-lectina de dominio de la familia 3, miembro A (CLEC3A). Se profundizó en el estudio de expresión proteica e inmunohistoquímica de TNC, VCAN y FN por sus implicaciones en el remodelado y cicatrización tisular (‘wound healing’). Demostramos como TNC se localiza específicamente en los focos de fibroblastos (FF), donde presenta un gradiente subepitelial y comparte localización con VCAN y FN. Tanto VCAN como FN están también presentes de forma difusa en la MEC junto con colágeno tipo I.
A nivel experimental, observamos como los fibroblastos fibróticos expresan niveles basales e inducidos más altos de TNC y α-smooth muscle actin (α-SMA) que los fibroblastos de pulmones normales. TGF-β1 activa la síntesis de ambas proteínas, induciendo antes la expresión génica de α-SMA que la de TNC. Sin embargo, al cultivar fibroblastos normales bajo condiciones tridimensionales de colagenización, glicación y endurecimiento, la secreción de TNC y la formación de α-SMA se induce sin ningún estímulo externo, sólo con la interacción con la MEC donde se encuentran inmersos. Estos resultados sugieren que los factores asociados a la MEC como el colágeno tipo I, así como la formación de los productos finales de la glicación (advanced glycation end-products o AGEs) con los puentes de unión secundarios y el endurecimiento de las matrices obtenido mediante dicha glicación, modifican las características y el comportamiento celular, convirtiendo al fibroblasto normal a un fenotipo pro-fibrótico (miofibroblasto), capaz de generar proteínas de MEC características en fibrosis pulmonar como es TNC.
Las condiciones de glicación con ribosa que permiten la adecuada viabilidad y proliferación de los fibroblastos inmersos en la MEC tridimensional colagenada son ribosa 5, 15 y 30 mM. Se ha comprobado que concentraciones muy elevadas de ribosa (240 mM) son citotóxicas tanto en 2D como en 3D. La glicación no-enzimática del colágeno produce; a) formación de AGEs de manera dosis-dependiente, y los crosslinks secundarios a dicha glicación producen b) cambios en la conformación del colágeno y c) endurecimiento de la matriz. Estos factores, junto con la transformación celular (fenotipo contráctil o α-SMA +) que se produce desde el 7º día de cultivo, así como la síntesis de otras proteínas de MEC como TNC, pueden contribuir al propio endurecimiento de las matrices y a la contractilidad de las mismas observada a partir de los 16 días de cultivo.
Conclusiones: Las proteínas de MEC de pulmones con FPI difieren de las proteínas de MEC de pulmones normales y de otras enfermedades pulmonares intersticiales. TNC y VCAN se encuentran sobreexpresadas en pulmones fibróticos con patrón histológico de NIU respecto controles y no-fibróticos, observándose co-localización de las mismas en los focos de fibroblastos y en zonas α-SMA positivas, lo que sugiere pueden jugar un papel en la reparación-cicatrización anómala de la fibrosis. La especificidad de TNC para los focos fibroblásticos sugiere que esta glicoproteína podría representar un biomarcador a explorar en enfermedad pulmonar fibrosante.
El nuevo modelo de cultivo tridimensional con colágeno tipo I modificado mediante glicación no-enzimática puede recrear las condiciones tridimensionales y biomecánicas de matrices extracelulares fibróticas y envejecidas que permitiría el estudio de las proteínas implicadas en las diferentes rutas de señalización de la FPI, así como la relación entre la glicación con la fibrosis y el envejecimiento pulmonar. Este modelo de cultivo, permitiría además, testar en un futuro el efecto de posibles tratamientos, como anti-AGEs y antifibróticos, que puedan inhibir por diferentes vías, las características oxidativas y fibrogénicas de este complejo célula-matriz extracelular.
