Hacia el entendimiento del control de la expresión génica del regulón cianobacteriano del nitrógeno mediado por el factor de transcripción ntca y la proteína reguladora pipx
- Autores: Alicia Forcada Nadal
- Directores de la Tesis: Vicente Rubio Zamora (dir. tes.), José Luis Llácer Guerri (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2018
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Joaquin Moreno Mariño (presid.), Asunción Contreras de Vera (secret.), José Manuel García Fernández (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina y Biotecnología por la Universitat de València (Estudi General)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: RODERIC
- Resumen
NtcA, es un factor de transcripción cianobacteriano perteneciente a la familia CRP. Es considerado el regulador global del nitrógeno en cianobacterias ya que presenta un regulón muy amplio que incluye muchos genes implicados en el metabolismo de nitrógeno. Se activa por 2-oxoglutarato(2-OG), un indicador del nivel de nitrógeno celular y es coactivado por una proteína llamada PipX, objeto importante de este estudio. A bajo nivel de 2-OG, PipX es secuestrada por la proteína señalizadora PII quedando inaccesible para activar NtcA. Sin embargo, la unión de 2-OG a PII en condiciones de escasez de nitrógeno, libera PipX, la cual queda accesible para coactivar NtcA. Las estructuras de NtcA unido a 2-OG, así como a PipX y 2-OG ya habían sido determinadas previamente en nuestro laboratorio, en esta tesis presentamos la estructura de NtcA unido a su DNA diana y también la estructura del complejo NtcA-PipX-DNA. Estas estructuras aclaran el mecanismo de la especificidad de NtcA por el DNA y muestran que PipX no interacciona con este, sino que estabiliza la conformación activa de NtcA. Así, la unión de PipX a NtcA desplaza el equilibrio entre las formas inactivas del factor de transcripción en favor de su forma competente para unir DNA. Aquí presentamos la estructura de tres formas inactivas de NtcA, sin 2OG unido, demostrando que la conformación inactiva no es específica de especie, sino que existen varias conformaciones inactivas para cada especie. Además, en el complejo PII-PipX, la hélice C-terminal de PipX se encuentra extendida, proporcionando una oportunidad para interaccionar con otras posibles dianas, lo que no podría ocurrir en el complejo NtcA-PipX, donde dicha hélice está siempre flexionada. Nosotros hemos propiciado la determinación de la estructura de PipX por RMN, probando que PipX cuando está libre, presenta su hélice C-terminal flexionada. Recientemente, un regulador génico putativo ha sido identificado como una diana de PipX en el complejo ternario PII-PipX-PlmA. Ya que solo elementos de PipX parecen interaccionar con PlmA en este complejo ternario, parece que PII actúa como un “abridor” de la hélice C-terminal de PipX, promoviendo el secuestro de PlmA en este complejo. Por otra parte, mediante resonancia de plasmón hemos investigado la unión de las proteínas NtcA y CRP a promotores con secuencias consenso canónicas y no canónicas, en ausencia y presencia de sus efectores y/o de la proteína PipX para estudiar qué hace a algunos genes del regulón de NtcA más o menos sensibles a NtcA dependiendo de la presencia o ausencia de 2OG y PipX, y la posible activación cruzada de los promotores de NtcA o CRP, ya que ambos reconocen secuencias de DNA similares. Los resultados muestran que NtcA puede unirse a los promotores dependientes de CRP pero no al revés, además que CRP es incapaz de unirse a su promotor en ausencia de cAMP mientras que NtcA si se une a sus promotores en ausencia de 2OG, aunque con una afinidad menor que en su presencia. También hemos encontrado que la afinidad efectiva de NtcA por el 2OG está muy influenciada por el promotor y que PipX aumenta esta afinidad de forma importante, uniéndose solo a NtcA en presencia de 2OG, apoyando la visión de que PipX estabiliza la conformación activa de NtcA unida a 2OG.
