Strategies to find optimal resolution in liquid chromatography
- Autores: Tamara Álvarez Segura
- Directores de la Tesis: José Ramón Torres-Lapasio (dir. tes.), Mª Celia García Alvarez-Coque (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2019
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Santiago Maspoch Andrés (presid.), Clara Ràfols Llach (secret.), Alain Berthoz (voc.)
- Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Química
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- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
La cromatografía líquida de alta resolución o alto rendimiento es actualmente la técnica de separación analítica más utilizada, debido a su versatilidad, fiabilidad, robustez y sensibilidad. Desafortunadamente, en cromatografía líquida, la eficacia suele ser inferior a la ofrecida por la cromatografía de gases, electroforesis capilar y otras técnicas de electromigración. Con una menor eficacia, no es posible el análisis de muestras de muy elevada complejidad. Así, se ha dedicado un considerable esfuerzo en investigación, tanto básica como aplicada, al incremento de la eficacia y selectividad, produciéndose avances muy significativos desde los orígenes de la técnica.
A pesar de los progresos conseguidos en las últimas décadas, con el desarrollo de una instrumentación cada vez más sofisticada (incluida la introducción de bombas de presión ultra-alta) y los avances en la tecnología utilizada para preparar columnas (con la síntesis de nuevos soportes y fases estacionarias), quedan desafíos por resolver, puesto que la necesidad de analizar muestras cada vez más complejas, en tiempos más cortos, es permanente.
Las investigaciones realizadas a lo largo del desarrollo de la Tesis Doctoral, y recogidas en la presente Memoria, contribuyen a la mejora del rendimiento de la cromatografía líquida, particularmente en su variante de fase inversa. Concretamente, se realizan propuestas relacionadas con la optimización de sistemas multi-columna en cromatografía líquida monodimensional y el desarrollo de nuevas funciones objetivo para medir la capacidad separativa de los sistemas cromatográficos, con motivos de optimización. La Memoria también incluye un desarrollo fundamental que mejora la medida de la dispersión producida en las columnas cromatográficas. A continuación, se resumen las investigaciones realizadas.
1. Optimización de sistemas multi-columna en cromatografía líquida monodimensional El nivel máximo de resolución que es capaz de proporcionar una sola columna resulta a menudo insuficiente. Una solución relativamente sencilla es el acoplamiento de dos o más columnas convencionales, mediante acopladores de volumen muerto cero. Esta estrategia permite modular la naturaleza de la fase estacionaria para adaptarla a las necesidades de resolución y tiempo de análisis de una muestra determinada. Una segunda ventaja es que se puede implementar en instrumentos cromatográficos convencionales (equipados con una única bomba), y utilizar cualquier tipo de columna, siempre y cuando las condiciones de elución sean compatibles. En la actualidad se comercializan columnas cortas con fases estacionarias muy distintas y múltiples longitudes, lo que multiplica las posibilidades de éxito de los acoplamientos en serie.
La Memoria de Tesis incluye una revisión bibliográfica que analiza los desarrollos propuestos hasta la fecha, basados en la aplicación de la estrategia de combinación de columnas en serie. En los artículos publicados, los autores indicaron que no fueron capaces de resolver sus muestras con columnas individuales, mientras que encontraron una sustancial mejora cuando combinaban dos o más columnas. El acoplamiento de columnas en serie resulta, además, particularmente interesante para resolver el denominado “problema general de la resolución cromatográfica”: la obtención de tiempos de retención que aumentan exponencialmente con la hidrofobicidad de los solutos, y cuya corrección conduce inevitablemente a la coelución de los solutos menos hidrofóbicos. La incompatibilidad entre la mejora del nivel de resolución y la disminución del tiempo de análisis constituye probablemente la mayor limitación de las separaciones isocráticas. Hasta ahora, la solución más usual ha sido la aplicación de elución en gradiente. El acoplamiento de columnas en serie puede constituir una solución alternativa a los gradientes, con importantes mejoras en la selectividad. Esto representa un estímulo para el desarrollo de nuevos procedimientos isocráticos, especialmente en combinación con detección mediante espectrometría de masas.
En la Memoria de Tesis se investigan algunas estrategias para que la metodología de acoplamiento de columnas resulte de utilidad para los laboratorios de rutina e investigación, sobre todo desarrollando métodos de optimización de las condiciones de elución (contenido de disolvente orgánico, flujo o temperatura), y de selección de la combinación de columnas más apropiada, tanto en modo isocrático como en gradiente. Aunque todavía no es posible proporcionar recomendaciones específicas sobre las columnas que resultarán a priori más adecuadas para una aplicación particular, se puede afirmar que basta considerar una pequeña cantidad de fases estacionarias convencionales (por ejemplo, C18, ciano, amino y fenilo), para mejorar muy sustancialmente la resolución en separaciones donde aisladamente fallan. Una correcta selección de columnas (naturaleza y longitud), y de eluyente (fase móvil isocrática o programa de gradiente), multiplica de manera impresionante las probabilidades de éxito, especialmente a través de la aplicación de estrategias de optimización interpretativa y simulaciones por ordenador. El uso de columnas acopladas en serie tiene la ventaja de ser accesible a cualquier laboratorio, frente a las separaciones bidimensionales, que requieren una inversión y capacitación muy importantes, por lo que son mucho más restrictivas.
Con la conexión en serie de dos o más fases estacionarias mediante columnas de diferente longitud se produce una transición casi continua de selectividad, que permite adaptar el sistema separador a los requisitos de una muestra en particular. Las consecuencias de combinar columnas que contienen diferentes fases estacionarias en serie equivalen, a nivel de resultados, a lo que en el laboratorio conseguiríamos si dispusiéramos de cientos, miles o incluso millones de columnas. Puesto que cada combinación de columnas se comporta como una nueva columna, el hecho de combinarlas en serie equivale a multiplicar la cantidad de columnas disponibles en el laboratorio. Con ello, la probabilidad de disponer de la “columna ideal” aumenta enormemente. Sin embargo, para conseguir convertir a la estrategia de combinación de columnas en una herramienta general, verdaderamente poderosa para la resolución de muestras complicadas, se han de resolver antes algunos problemas técnicos.
Primero, las columnas cromatográficas se deben poder conectar sin afectar a la naturaleza de la fase estacionaria en la proximidad de las conexiones entre columnas, y sin introducir volúmenes muertos. Estos problemas se han resuelto mediante el uso de conectores de volumen muerto cero, que disponen de roscas universales y permiten la conexión directa de columnas de distintos fabricantes, de un modo fiable y reproducible. En segundo lugar, se necesita un sistema que anticipe la combinación más correcta, y optimice su rendimiento. Para ello, se ha perfeccionado, dotándolas de nuevas características, algunas herramientas anteriormente desarrolladas en el laboratorio de investigación para la optimización de columnas individuales, tanto en separaciones isocráticas, como en gradiente. Con todo ello se construyó un software que permite explotar en todo su potencial las ventajas que ofrece la combinación de columnas en serie.
Seguidamente, se presentan algunos estudios sobre las posibilidades que ofrecen los métodos que utilizan columnas acopladas en serie para cromatografía líquida y se detallan las herramientas matemáticas necesarias para realizar la optimización de las condiciones de separación. Se estudia la separación de una mezcla de 15 sulfonamidas, considerando cuatro tipos de fase estacionaria de diferente naturaleza: dos columnas C18 (una convencional y otra que incluye grupos polares), y otras dos que contienen una fase fenilo o una fase ciano. Todas estas columnas mostraron, cuando se utilizaron individualmente, un rendimiento insuficiente para la separación de las 15 sulfonamidas. Sin embargo, al usar una combinación optimizada de columnas, se obtuvo una excelente separación, tanto en términos de resolución como de tiempo de análisis. Estos resultados sugieren que se conseguirán igualmente buenas resoluciones en otras muestras complejas.
En realidad existen dos formas de conseguir que dos o más columnas cooperen en separaciones monodimensionales: su combinación en serie o en paralelo. En el segundo caso, se deben realizar dos (o más) inyecciones, cada una de ellas con una columna distinta, o bien dividir el flujo de fase móvil en dos corrientes idénticas, haciendo pasar cada una de ellas por una columna y detector distintos, ejecutando una única inyección. En la Memoria de Tesis se estudian las prestaciones de cada una de estas formas de acoplamiento, utilizando de nuevo la mezcla de 15 sulfonamidas y fases móviles en las que se modifica solamente un factor experimental (el contenido de disolvente orgánico), realizando la elución en régimen isocrático.
La optimización de columnas en paralelo de diferente naturaleza se llevó a cabo aplicando el principio de complementariedad al caso de dos inyecciones independientes (nótese que igualmente se puede extender a más de dos). Este principio se basa en dedicar una condición de separación a la resolución óptima de sólo algunos compuestos en la muestra, mientras que los otros -que permanecen sin resolver-, son resueltos de manera óptima en una segunda condición de separación. El rendimiento de las diferentes configuraciones se evaluó mediante el cálculo de las resoluciones limitantes (máximo nivel de resolución ideal que se puede conseguir considerando todas las condiciones posibles de separación) y el porcentaje de capacidad de separación alcanzado en las condiciones óptimas, con cada sistema cromatográfico (refiriendo las resoluciones óptimas alcanzadas a los valores limitantes).
En el caso de estudio, la separación en serie superó ampliamente en prestaciones a las columnas en paralelo. En un estudio anterior, se había demostrado que si se introducía una mayor diversidad en la composición de la fase móvil (por ejemplo, uso de dos modificadores, o contenido de disolvente orgánico junto al pH), se obtenían buenas separaciones para muestras altamente complejas, utilizando una única columna e inyecciones paralelas. En el ejemplo estudiado, sin embargo, se utilizó sólo un factor en la fase móvil (la concentración de un único disolvente orgánico), por lo que las variaciones que se consiguen en la selectividad al cambiar la composición de la fase móvil son mucho más pequeñas, y por lo tanto, también las posibilidades de éxito.
Las consecuencias de las variaciones en longitud de las columnas son muy diferentes dependiendo de que el acoplamiento se realice en serie o en paralelo. En las separaciones en paralelo, no se producen cambios en la selectividad, mientras que la longitud de las columnas afecta muy notablemente a la selectividad en las separaciones en serie. Por lo tanto, aunque se intente realizar la comparación entre ambos métodos en idénticas condiciones, para evitar favorecer a una de las opciones, es imposible evitar la ventaja intrínseca que poseen las columnas acopladas en serie: la existencia de un factor de separación adicional (la longitud de la columna), con dramáticos efectos sobre la selectividad.
En la Memoria de Tesis se demuestra que, incluso aquellas columnas que ofrecen un rendimiento separador muy bajo cuando se usan de forma aislada, pueden dar lugar a una separación completa cuando se acoplan en serie. En nuestro estudio demostramos que, si bien las combinaciones que ofrecían una mejor resolución implicaban cuatro columnas, era posible encontrar soluciones alternativas excelentes acoplando sólo dos columnas de polaridad diferente (como fenilo y ciano). Curiosamente, la mejor combinación tenía una mayor contribución de la columna más rápida colocada en primera posición. Esta misma conclusión se ha observado sistemáticamente en otras separaciones, por lo que constituye una recomendación general.
Por otro lado, es necesario comentar que con el uso rutinario, las columnas cromatográficas inevitablemente sufren un deterioro gradual y, como resultado, el nivel de resolución en los cromatogramas reales difiere progresivamente de los resultados esperados. Cuando el nivel de deterioro es ya considerable, es necesario pronosticar unas nuevas condiciones de separación óptimas, puesto que los modelos descriptores de la retención y forma de los picos, desarrollados inicialmente, ya no son válidos. El cromatografista se ve entonces en la coyuntura de decidir si repite todo el proceso experimental de modelización (lo que resulta poco deseable, ya que supondría el consumo de tiempo y reactivos, particularmente cuando se utiliza una metodología en la que aparecen involucradas varias columnas acopladas), o bien corrige los pronósticos, a partir de un número reducido de experiencias que cuantifiquen el cambio en el rendimiento separador.
En la Memoria de Tesis, se desarrolla un método práctico para adaptar las predicciones de tiempo y perfil de pico a las nuevas condiciones, en las que la(s) columna(s) ha(n) perdido capacidad separadora por envejecimiento. Así, los modelos originales se corrigen mediante la introducción de parámetros que cuantifican el nivel de deterioro, que se obtienen a partir de la elución de un pequeño subconjunto de compuestos. Dichos compuestos se seleccionan de entre aquéllos medidos en el conjunto de entrenamiento, con una elución representativa, comparando las medidas antes y después de haber sufrido las columnas pérdidas en su rendimiento. Los parámetros de envejecimiento son comunes para el conjunto de solutos analizados, y se obtienen por regresión, de tal manera que se minimizan las discrepancias entre los datos predichos con los modelos de retención originales para la columna completamente nueva, y los datos experimentales medidos para la columna envejecida.
El método de corrección fue desarrollado y validado mediante la predicción del comportamiento cromatográfico del conjunto de 15 sulfonamidas anteriormente utilizado, que se analizó con las columnas individuales y combinadas en serie, utilizando tanto elución isocrática como de gradiente. A partir de la cuantificación del envejecimiento, se pronosticó el comportamiento separador esperado para el conjunto de compuestos con una columna o un conjunto de columnas acopladas. Se observó una concordancia excelente entre los cromatogramas previstos y experimentales en las columnas envejecidas.
Los resultados sugieren que, siempre que las columnas mantengan un rendimiento suficiente, es posible aprovechar el extenso trabajo experimental realizado cuando el sistema se modelizó para las columnas recién estrenadas. Con esta información, y un esfuerzo experimental adicional mínimo, es posible obtener predicciones exactas en condiciones de degradación moderada. Por lo tanto, la modelización completa del comportamiento cromatográfico sólo se lleva a cabo cuando las columnas son nuevas o los solutos se analizan por primera vez.
Quizá la principal limitación del método propuesto es que el tratamiento no considera efectos específicos (dependientes del soluto), que se ven amplificados cuando el nivel de deterioro es grave. Además, si los cambios en la química de la columna afectan a la cinética de adsorción-desorción, las predicciones de semi-anchura también serán dependientes del soluto. La corrección de estos efectos implica un mayor esfuerzo experimental, por lo que se pierde el interés práctico de la metodología propuesta. Por supuesto, desde una perspectiva de calidad, las columnas antiguas deben regenerarse o reemplazarse si sus parámetros de separación (es decir, eficacias, factores de retención o selectividades) no cumplen con los criterios aceptables. Pero para un laboratorio de rutina, sacrificar una columna que todavía puede ofrecer buenas separaciones es antieconómico e irracional.
La última investigación incluida en este apartado de la Memoria de Tesis desarrolla un nuevo método de separación, utilizando columnas en serie, para el análisis de aminoácidos. A lo largo de los años, se ha invertido un gran esfuerzo en el desarrollo de métodos para analizar estos compuestos. Algunos métodos publicados tratan sobre la separación de los derivados (isoindoles) del o ftalaldehído/N-acetil-L-cisteína de los 19 aminoácidos proteicos primarios, utilizando elución en gradiente. Sin embargo, con frecuencia los derivados sólo pueden ser resueltos en tiempos de análisis excesivamente largos, incluso cuando se utilizan gradientes multi-lineales o multi-isocráticos. Si se intenta reducir el tiempo de análisis, se produce la coelución parcial de varios compuestos. El uso de columnas individuales es, por lo tanto, insuficiente para resolver separaciones complejas de estos analitos, debido a su funcionalidad limitada y elevados tiempos de análisis.
Considerando los pronósticos de tiempos de retención, la ecuación de Neue-Kuss dio lugar a las mejores predicciones, para todas las columnas ensayadas. Sin embargo, la elevada diferencia de polaridad entre los derivados de los aminoácidos originó retenciones fuera de escala (demasiado cortas o demasiado elevadas), de modo que las medidas eran sólo viables en dominios estrechos de disolvente orgánico, específicos de cada aminoácido. Fuera de estos dominios, las predicciones de retención deben ser extrapoladas, y su nivel de incertidumbre puede crecer hasta niveles inaceptables. Las consecuencias indeseables de operar fuera de márgenes y la obtención de separaciones exponenciales se atenuaron cuando las columnas se acoplaron en serie y la elución se llevó a cabo en gradiente, lo que disminuyó el tiempo de análisis de la mezcla de aminoácidos y repartió los solutos a lo largo de la ventana de elución. Las predicciones obtenidas fueron muy satisfactorias.
La complementariedad de interacciones entre las columnas PFP-C18 y C4 dio como resultado una resolución de los aminoácidos muy superior a la encontrada con cada columna por separado. No fue, sin embargo, posible disminuir el tiempo de análisis por debajo de los 50 min con las columnas utilizadas, debido a la coelución parcial de los isoindoles de los aminoácidos más retenidos (triptófano, fenilalanina, leucina y lisina), que muestran una hidrofobicidad demasiado similar, y picos muy amplios.
2. Desarrollo de nuevas funciones objetivo cromatográficas La obtención de información química útil, en muestras que contienen múltiples compuestos, sigue constituyendo un desafío importante para un analista. La mayor complejidad corresponde a aquellas muestras en las que no se dispone de conocimiento previo sobre su composición química, o cuando se carece de estándares para todos o algunos constituyentes. La mayoría de las funciones para medir el rendimiento de la separación (i.e., funciones objetivo cromatográficas, COFs del inglés “chromatographic objective functions), descritas en la bibliografía, no son aplicables en estas circunstancias. En la Memoria de Tesis, se propone y valida una nueva COF que viene a suplir las carencias de las COFs convencionales, para tales situaciones. El objetivo último de esta investigación es la mejora de los análisis de hierbas medicinales mediante la obtención de huellas dactilares cromatográficas.
Las huellas dactilares cromatográficas son cromatogramas de muestras de alta complejidad, como las que se encuentran en materiales biológicos y ambientales, con múltiples picos de diferentes alturas. Los picos de mayor tamaño pertenecen a componentes en concentraciones relativamente altas, mientras que los picos más pequeños pueden corresponder a compuestos a nivel traza, productos de degradación a diferentes concentraciones, impurezas introducidas en muestras particulares o ruido instrumental. Los cromatogramas obtenidos son útiles para determinar la identidad de las muestras, comparando las huellas dactilares de diferentes muestras, y llevando a cabo análisis de similitud y diversos métodos de clasificación.
La cuantificación de cromatogramas exige señales en las que, idealmente, cada componente debe estar completamente aislado del resto. Las condiciones que permiten tal nivel de separación se determinan de manera rutinaria a partir de la información proporcionada a partir de la inyección de estándares en un pequeño número de condiciones de elución, desarrolladas de acuerdo a un determinado diseño experimental. Sin embargo, cuando se analizan muestras en las que la identidad de los constituyentes es parcial o totalmente desconocida, y en consecuencia, se carece del soporte que puede aportar el uso de estándares para el desarrollo de métodos de separación, el cromatografista no puede aplicar las metodologías habituales de selección de las condiciones experimentales más adecuadas.
En la Memoria de Tesis, se presenta el desarrollo de un algoritmo no supervisado (COF), que mide el nivel de información en los cromatogramas a través del concepto de prominencia de pico, que mide la resolución de los picos de un cromatograma, sin la necesidad de disponer de estándares. La prominencia de un pico se define como la fracción de área de un pico que sobresale respecto de los valles que lo delimitan (o la línea base). La combinación de valores de prominencia permite caracterizar la calidad de la separación de cromatogramas con diversos niveles de solapamiento y cantidades relativas de los solutos.
Las prestaciones de la combinación de prominencias fue evaluada utilizando una mezcla de seis compuestos de prueba, cuyo comportamiento cromatográfico (tiempos de retención y semi-anchuras de pico) se caracterizó cuidadosamente. A partir de los modelos construidos, se realizaron pronósticos de separación en condiciones diversas. Finalmente, se dibujó un diagrama que representaba la resolución frente a la composición de la fase móvil, de acuerdo con los criterios de prominencia de pico y pureza de pico (que mide el área superpuesta de un pico con otros picos en un cromatograma). La comparación realizada con el criterio de pureza de pico se debe a que este criterio es considerado como el mejor para evaluar la resolución, aunque posee el inconveniente de requerir de estándares de los solutos eluidos.
La prominencia de pico ofreció una gran sensibilidad para detectar cambios en la configuración de los cromatogramas, respondiendo sólo a los picos perceptibles. Las ventajas de este criterio son las siguientes: (i) no requiere de estándares, (ii) proporciona medidas asociadas a cada pico individual, lo que facilita la combinación ordenada de las resoluciones elementales y el recuento de picos, (iii) es sensible al perfil y tamaño de las señales, (iv) es una medida normalizada de fácil interpretación, (v) se puede medir a partir de la señal global bruta, y (vi) atiende a todos los picos del cromatograma, independientemente de que correspondan a uno o más compuestos.
Debe tenerse en cuenta que incluso con mezclas simples (como las formadas por los seis compuestos de prueba), se pueden observar más picos de los esperados en los cromatogramas. El estudio sugirió que el parámetro más significativo para caracterizar las huellas dactilares cromatográficas con picos múltiples, de tamaño muy distinto, es el número de picos perceptibles (recuento de picos significativos). Por otro lado, la resolución global sólo debe calcularse para los picos significativos. Dado que se desconoce el número real y la naturaleza de los componentes en estas muestras, es necesario establecer un umbral para discriminar entre los picos significativos y aquéllos que no son reproducibles en el procesamiento de datos (artefactos, picos de impurezas o ruido instrumental). En el estudio realizado, se consideraron significativos los picos que excedían un umbral preseleccionado de 0.05% del área de prominencia de pico relativa.
Otro de los capítulos de la Memoria de Tesis describe los factores necesarios para optimizar las condiciones de extracción y conservación de las hierbas medicinales, utilizando diseños experimentales de Plackett-Burman. El método descrito fue aplicado a muestras de té verde. Para cada factor experimental, se establecieron niveles de monitorización extremos. Debido a la incompatibilidad entre los factores experimentales, fue necesario distribuirlos en dos grupos. En una primera etapa, sólo se estudió la concentración de disolvente orgánico, el tiempo de sonicación (ultrasonidos) y la temperatura de la extracción. Se llevó a cabo una investigación independiente, utilizando acetonitrilo, etanol y metanol como disolventes de extracción. En una segunda etapa, se investigó la influencia del peso de la muestra, y del tiempo y la temperatura de conservación.
Para optimizar las condiciones de extracción, los picos en las huellas dactilares se clasificaron de acuerdo a las áreas de prominencia de pico. El análisis de los resultados demostró que el metanol era el mejor disolvente, y que debería utilizarse preferiblemente en mezclas con agua al 30%, utilizando un tiempo de sonicación de 60 min y una temperatura de 80 ºC. El peso de la muestra contribuyó muy significativamente al número de picos observados, valor que se incrementaba cuando la temperatura de conservación era más elevada (4 ºC frente a ̶ 10 ºC), probablemente debido a la degradación de algunos compuestos a mayor temperatura. Por ello, el análisis debería realizarse inmediatamente después de realizar la extracción.
Aunque el método fue aplicado a muestras de té verde, la metodología es adecuada para encontrar las mejores condiciones de extracción y conservación de otros tipos de hierbas medicinales. Se espera que la prominencia de pico, junto con una estrategia adaptada a este tipo de muestras, sea útil para optimizar el programa de gradiente para análisis cromatográfico, a fin de obtener huellas dactilares de la más alta calidad.
La Memoria de Tesis propone y valida también una función de resolución global adecuada para situaciones de separación generales (en presencia o ausencia de estándares). La función, basada en la medida no supervisada de prominencias de pico, fue implementada en MATLAB y automatiza el análisis de los cromatogramas con substracción previa de la línea base, detección completa de todos los picos y cálculo de sus propiedades. El rendimiento proporcionado por esta función fue comparado con el ofrecido por la pureza de pico. Para la validación se tomó como caso de estudio la separación de una mezcla de los derivados de OPA/NAC de los 19 aminoácidos proteicos primarios, bajo elución en gradiente. Como se ha comentado anteriormente, cuando se analizan con una columna aislada, estos compuestos pueden resolverse completamente sólo en tiempos de análisis excesivamente largos, y ni siquiera el uso de gradientes multi-lineales o multi-isocráticos consigue reducir los tiempos. Cualquier intento de reducción conduce a una superposición inaceptable de dos o más compuestos. Sin embargo, estas dificultades hacen muy interesante esta separación para evaluar funciones de resolución.
Se predijo la separación de los derivados de los aminoácidos, simulando alrededor de 1100 gradientes que barrían concentraciones en el intervalo 5‒27.5% de acetonitrilo. Para realizar las simulaciones, se utilizó la información (valores de retención y anchura de pico) suministrada por los estándares de los aminoácidos, cuando se eluyeron los derivados en 10 condiciones isocráticas. Se consideraron distintos niveles de dificultad: picos cromatográficos con áreas similares y con diferencias sustanciales en magnitud, en presencia y ausencia de compuestos desconocidos, con diferentes niveles de ruido, e incluyendo líneas base muy irregulares.
Se compararon varias funciones de resolución global, en base a la coincidencia de los gradientes elegidos como óptimos de Pareto resolución-tiempo de análisis, utilizando dos criterios de resolución: prominencia y pureza de pico. La evaluación de la pureza de pico exige un conocimiento exhaustivo de cómo son las señales individuales de cada compuesto, en cada condición experimental, de modo que sólo es determinable mediante simulaciones. La prominencia de pico, en cambio, hace uso de la señal combinada, sin requerir ninguna información previa sobre el número de compuestos que la muestra contiene, de modo que es posible medir la resolución global cuando la única información disponible es un cromatograma experimental, sin necesidad de la información de estándares.
La aplicación práctica a muestras reales de huellas dactilares exige solucionar el problema de las diferencias de magnitud entre constituyentes (e.g., componentes mayoritarios y traza) para comparar la resolución en los cromatogramas. Una buena función de resolución global debe ser insensible a estas diferencias, y a la vez conseguir una buena equivalencia entre las condiciones seleccionadas como óptimas por la prominencia y pureza de pico. Es decir, la definición de función global de resolución ensayada para la prominencia de pico ha de seleccionar los mismos gradientes óptimos que los que se habrían elegido en base a la pureza de pico. Ello permitiría comparar condiciones experimentales a la hora de realizar una optimización. De entre las funciones ensayadas, se seleccionó una basada en el uso de valores normalizados referidos a cada pico individual, de modo que si todos los picos quedan completamente resueltos, coincide la medida con el número de compuestos eluidos. En efecto, la coincidencia de condiciones óptimas entre los gráficos de Pareto de prominencia y pureza de pico, para la función seleccionada, indicó un rendimiento similar para ambos criterios, incluso aunque una de ellas (la prominencia) disponga de un nivel de información sobre la muestra mucho más pobre.
La Memoria de Tesis incluye también estudios sobre el uso de la selectividad multivariante de segundo orden (que incorpora información temporal y espectral proporcionada por un detector de fila de diodos) como función de resolución, con motivos de optimización. La optimización de la resolución en cromatografía líquida se realiza tradicionalmente atendiendo sólo a la información temporal. Sin embargo, algunos compuestos pueden permanecer solapados, incluso bajo las condiciones de elución seleccionadas como óptimas. Esta insuficiente resolución se puede complementar por medios matemáticos deconvolucionando los picos solapados. La calidad del resultado se incrementa considerablemente si se incluye información espectral en el proceso de deconvolución.
La selectividad multivariante se relaciona con el seno del ángulo que forma en el espacio multidimensional la señal del analito, respecto de la señal de los interferentes. Esta COF es sensible a las diferencias temporales y espectrales, cuando dos o más componentes coeluyen en una mezcla. En un estudio anterior se habían probado las prestaciones de esta COF con una mezcla de fenoles, que poseían diferencias espectrales apreciables. En el estudio incluido en esta Memoria, la selectividad multivariante de segundo orden evalúa las posibilidades de resolución cuando existen compuestos con espectros similares, que coeluyen parcial o completamente. Éste es el caso de una muestra que contiene los derivados de OPA/NAC de los aminoácidos proteicos, donde algunos compuestos presentan espectros idénticos y otros son sólo ligeramente diferentes.
La aplicación de la selectividad multivariante permite seleccionar las condiciones experimentales que darán lugar a cromatogramas que muestran picos solapados, pero que pueden recuperarse mediante deconvolución con garantías de éxito, en casos donde la separación completa es imposible. Para realizar la deconvolución, se utilizó la aproximación de proyecciones ortogonales y mínimos cuadrados alternantes. La aproximación de proyecciones ortogonales es una técnica de análisis multivariante, que permite localizar los espectros más puros en un espectrocromatograma. Los mínimos cuadrados alternantes reflejan los perfiles de concentración en un espectrocromatograma, para encontrar espectros normalizados, y viceversa, tras aplicar una serie de restricciones a los resultados.
Era posible resolver satisfactoriamente la mezcla de derivados de los aminoácidos, utilizando una columna C18 y un gradiente de acetonitrilo-agua, aunque en tiempos de análisis demasiado elevados. Al aumentar la fuerza eluyente, los tiempos de retención disminuían, produciéndose solapamientos importantes entre picos. La optimización basada en la selectividad multivariante permitió encontrar condiciones experimentales con tiempos de análisis más bajos, mediante la recuperación (con errores bajos) de los picos solapados mediante deconvolución, aprovechando las pequeñas diferencias espectrales existentes.
Los tiempos de análisis más cortos se obtuvieron utilizando gradientes multi-isocráticos, optimizados considerando tanto el tiempo de análisis como la resolución espectral. El gráfico de Pareto indicó que este tipo de gradientes era capaz de proporcionar una resolución espectral aceptable con un tiempo de análisis tan reducido como 20 min. Sin tener en cuenta la resolución espectral, el tiempo de análisis más corto que ofreció una resolución aceptable fue de 60 min.
3. Estudios fundamentales sobre el rendimiento de las columnas El estudio del rendimiento de una columna es de gran interés para caracterizar fases estacionarias, desarrollar nuevos materiales y aumentar la resolución de muestras complejas. Tradicionalmente, este estudio se ha realizado mediante la elución de un compuesto de prueba a diferentes flujos y la representación de los denominados gráficos de Van Deemter, que relacionan la altura de plato teórico de la columna con la velocidad lineal de fase móvil. El interés de estos gráficos reside en que pueden revelar las diferentes contribuciones al ensanchamiento del pico. Sin embargo, el método posee algunas desventajas, como son la necesidad de medir con exactitud la varianza extra-columnar (lo que puede ser complicado), la utilización de un único compuesto para conocer la relación entre la altura de plato teórico y la velocidad lineal (lo que limita las conclusiones del método), y el aumento de la incertidumbre debido a la manipulación de dos parámetros de pico (la posición y la varianza) para obtener los valores de altura de plato teórico.
Cuando la contribución extra-columnar no es despreciable, la altura de plato teórico depende de la retención del compuesto ensayado. Los compuestos que eluyen a bajos tiempos de retención proporcionan valores de altura de plato teórico mayores. Por lo tanto, las conclusiones obtenidas de un gráfico de Van Deemter pueden variar según el compuesto seleccionado para trazar el gráfico.
En el último capítulo incluido en la Memoria de Tesis, se propusieron y compararon tres métodos complementarios que evitan las desventajas anteriores. El estudio se realizó con los datos provenientes de la elución de cinco sulfonamidas, analizadas con columnas C18 de micropartículas y monolítica, utilizando mezclas de acetonitrilo y agua. Los resultados mostraron que es posible caracterizar las columnas con mayor fiabilidad respecto al método clásico, utilizando los métodos propuestos.
El primer método se basa en el tratamiento directo de las varianzas de pico de varios compuestos eluidos con una columna, utilizando una o varias condiciones de elución isocrática. A partir de la función ajustada a una relación lineal, de la representación de las varianzas frente al tiempo de retención al cuadrado, se obtiene la altura de plato teórico, cuyo valor se obtiene a varios valores de flujo. Es interesante comentar que la ecuación ajustada incluye la variación extra-columnar como parámetro de ajuste. En un segundo método, la varianza de pico para cada sustancia (expresada en unidades de volumen) se ajusta respecto del flujo, y los parámetros del modelo se relacionan con los factores de retención. El tercer método se basa en una combinación del primer y segundo métodos.
Así, los tres métodos propuestos permiten un estudio gráfico completo del rendimiento de una columna, basado en el comportamiento de un conjunto de compuestos de prueba, sin la necesidad de obtener previamente la varianza extra-columnar. Los métodos proporcionan información sobre cómo el factor de retención afecta a los parámetros A, B y C de la ecuación de Van Deemter, que describen la importancia de la difusión y la transferencia lenta de masa en la fase estacionaria.
El estudio se complementó examinando los factores que afectan a la incertidumbre de los datos cromatográficos, utilizados para construir los gráficos de Van Deemter: el tiempo de respuesta (relacionado con la frecuencia de muestreo), los límites de los picos, el ruido de los datos, el método utilizado para restar la línea base antes de proceder a evaluar los parámetros de dispersión de los picos, el procedimiento y la altura del pico para obtener la mejor evaluación de la varianza, y la metodología para medir la altura de plato teórico.
