Caracterización de una nueva fitasa y su expresión en pichia pastoris
- Autores: Ramon Marques Mascarell
- Directores de la Tesis: Rosa Aligué Alemany (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2018
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Josep Gasa Gasó (presid.), Juan José Pascual Amorós (secret.), Joan Serratosa Serdà (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad de Barcelona
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
RESUMEN El ácido fítico (mio-inositol 1,2,3,4,5,6-hexaquisfosfato) es el principal almacén de fósforo en cereales y legumbres (80% del fósforo total), principales componentes de los alimentos para animales (1). Sin embargo, los animales monogástricos, incluidos los humanos, tienen muy poca o ninguna actividad de fitasa en sus tractos y no pueden digerir el fósforo en forma de fitato. El fitato además de retener fósforo retiene minerales, particularmente calcio, energía (almidón) y proteínas reduciendo así la disponibilidad de estos hacia el animal.
Las fitasas son las enzimas con capacidad para mejorar la nutrición animal y humana a través de la degradación de fitato (hexafosfato de inositol, IP6), liberando fosforo y minerales que de otro modo no estarían disponibles para la absorción intestinal (2). Por otra parte, la utilización de fitasas, permite hacer asimilable un P que de otro modo es excretado y produce la eutrofización de las aguas (3).
Dada la importancia económica y medio ambiental del P, el estudio, identificación i aplicación de nuevas fitasas es tema permanente.
El objetivo de este trabajo es la identificación de una nueva fitasa con alta capacidad para hidrolizar fitato y expresarla a gran escala en Pichia pastoris. Para alcanzar este objetivo dividimos el estudio en tres partes: la puesta a punto del método de expresión de una fitasa descrita en P. pastoris, la identificación y caracterización de una nueva fitasa y por último la expresión a gran escala de la nueva fitasa en P. pastoris.
Después de poner a punto el método de expresión de proteínas en P. pastoris a través de la fitasa ya descrita de E. coli AppA2, realizamos una búsqueda en el banco genómico de datos con el fin de identificar nuevas fitasas no descritas hasta el momento.
Seleccionamos la fitasa de S. odorífera, denominada AppA-So, para su expresión en P. pastoris. Con el fin de aumentar la expresión y en consecuencia la actividad de AppA-So, realizamos la optimización de codones de AppA-So para P. pastoris y la fitasa optimizada se denomicó AppAs-OP. Se modificaron 166 codones de 400 codones de la secuencia AppA-So, representando el 41,5 % de codones. La fitasa optimizada AppAs-OP aumento su actividad respecto a la fitasa inicial AppA-So, unas 400 veces a las 79 h de inducción y unas 200 veces a las 91 h de inducción.
La fitasa codificada por AppAs-OP, muestra un 58% de homología con otras fosfatasas ácidas de histidina. Su actividad óptima es a 55oC y a pH de 4,5; y su actividad específica es de 1.123 U/mg a 37oC (temperatura del ensayo). Por otra parte, la proteína AppAs-OP mantenía más del 85% de su actividad inicial después de ser incubada bajo condiciones de pH variables (pH 2.5-6.5) a 37oC durante 3 h. AppAs-OP es resistente a la inactivación por calor, conservando el 90% de su actividad inicial después de ser incubada a 45oC durante 10 minutos. La característica más relevante de AppAs-OP, respecto a las fitasas descritas hasta momento, es la estabilidad de su actividad a lo largo del tiempo. AppAs-OP mantiene su actividad 8 h después de añadir el substrato, y dobla su actividad específica después de 4 h y media activa. Esta característica, junto las mencionadas, convierte a la nueva fitasa AppAs-OP en una enzima muy adecuada para el uso en la industria alimentari.
l. Rao DECS Rao KV Redd TP Redd VD. 2009. Molecular characterization
