Generation of a toolbox for the study of carpel and fruit development in brassicaceae

• Autores: Jose Moya Cuevas
• Directores de la Tesis: Cristina Ferrandiz Maestre (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2019
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Jesús Vicente Carbajosa (presid.), Soraya Pelaz Herrero (secret.), Simona Masiero (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina y Biotecnología por la Universitat de València (Estudi General)
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  • Tesis en acceso abierto en: TESEO
• Resumen

  • Las angiospermas son el grupo más grande y diverso de plantas terrestres y, a diferencia de las gimnospermas, el grupo más antiguo de plantas con semillas, sus óvulos están alojados y protegidos durante su desarrollo dentro del gineceo, en lugar de exhibir estructuras generalmente al descubierto. Los carpelos y los frutos son innovaciones evolutivas cruciales de las angiospermas. Estos carpelos facilitan la polinización y, después de la fertilización de los mismos, se transforman en frutos que protegen las semillas en desarrollo y ayudan a su dispersión. Para cumplir estas funciones, los carpelos y los frutos desarrollan tejidos altamente especializados que forman órganos complejos, los cuales se han diversificado enormemente en las plantas con flores. En la flor, podemos encontrar gineceos formados por un solo carpelo, por varios carpelos no fusionados o por una estructura sincárpica de múltiples carpelos fusionados. A pesar de la diversidad morfológica de los gineceos a lo largo de las angiospermas, todas comparten un plan estructural básico, donde Arabidopsis thaliana, una pequeña angiosperma dicotiledónea, se ha convertido en el organismo modelo más utilizado para la investigación en biología vegetal tanto básica como aplicada.

    Los meristemas florales surgen en la periferia del meristema apical del tallo (SAM) y, posteriormente, los primordios de los órganos florales comienzan a diferenciarse en verticilos. En el centro del meristema floral de Arabidopsis, la fusión congénita de dos carpelos origina finalmente el pistilo o gineceo, el órgano reproductor femenino. Ya en estadio de antesis, los diferentes módulos funcionales están claramente diferenciados. Siguiendo el eje apical-basal, encontramos el estigma, seguido de un estilo relativamente corto, un ovario bilocular y la posición basal está ocupada por un ginóforo de longitud reducida.

    El estigma es una capa unicelular de células epidérmicas especializadas con morfología alargada, las cuales forman las papilas estigmáticas; Durante la fertilización, estas papilas están implicadas en la adhesión y germinación del polen. El estigma también representa el comienzo del tracto de transmisión, un tejido que se organiza en células también alargadas y conectadas por plasmodesmos, el cual segrega una matriz extracelular rica en polisacáridos (ECM) y especializada en guiar el crecimiento de los tubos polínicos a través del estilo y el ovario en dirección a los óvulos.

    El estilo es un cilindro corto y compacto cuyas células epidérmicas están dispuestas en filas cortas y exhiben depósitos de cera; la parte central consiste en células elongadas axialmente pertenecientes al tejido del tracto de transmisión, a lo largo de las cuales crecen los tubos polínicos, y entre este núcleo central y las células epidérmicas hay un anillo de tejido vascular y tres filas de células de parénquima con clorofila. El origen de los tejidos apicales (estilo y estigma) son mediales, aunque solo ocupan posiciones apicales y muestran simetría radial.

    El ovario ocupa la mayor parte de la longitud del gineceo. Externamente, observamos dos valvas que terminan en dos o tres filas de células de menor tamaño, las cuales forman un surco longitudinal llamado margen de valva y son adyacentes al replum en posición medial. En una sección transversal del ovario podemos ver la distribución de los tejidos a lo largo del eje medio-lateral: las valvas, en una posición lateral, corresponden a las dos paredes de los carpelos,donde se distinguen varias capas de células.

    El septum se encuentra en una posición central o medial, donde los carpelos se fusionan a lo largo del tracto de transmisión, y junto con la placenta, ambos dividen el ovario internamente en dos lóculos que encierran los óvulos. Estos óvulos son estructuras complejas formadas por un núcleo central que alberga el saco embrionario, dos tegumentos, que envuelven al núcleo y un funículo que los conecta con el tejido de la placenta. Todos los tejidos ováricos muestran polaridad adaxial-abaxial. Por lo tanto, en la zona medial del ovario, el replum se encuentra en posición abaxial, formando una capa estrecha entre los márgenes de valva, mientras que el septum, el tracto de transmisión, la placenta y los óvulos son adaxiales. Las valvas, en posiciones laterales, también muestran polaridad abaxial-adaxial, tal y como se reflejan las diferentes capas celulares que las constituyen.

    Por último, el ginóforo, una estructura corta similar a un pedicelo, une el ovario a la base de la flor.

    Tras la fertilización de los óvulos, las células del ovario se dividen y expanden, el fruto se alarga y se diferencian una serie de tipos celulares, los cuales son esenciales para una correcta maduración y dispersión óptima de las semillas. El fruto seco y dehiscente de A. thaliana, también llamada silicua, es el representante de más de tres mil especies de la familia de las brasicáceas. Esta silicua alargada y cilíndrica, de uno a dos centímetros de largo y un milímetro de ancho, alberga unas cincuenta semillas desarrolladas. Tanto el desarrollo adecuado de las semillas dentro de la silicua, como la diferenciación de los tejidos necesarios para la dehiscencia del fruto, son los principales procesos de desarrollo que se producen después de la fructificación. Esta diferenciación tisular involucra principalmente el margen de la valva y el endocarpio b, que constituye la capa celular interna de las valvas. El margen de valva está entre las valvas y el replum y, una vez que está maduro, se convierte en la zona de dehiscencia (DZ). Esta zona comprende una capa de pequeñas células que forman la capa de separación, y define un plano longitudinal de ruptura a ambos lados del replum, junto con un área adyacente de células lignificadas que se extienden hacia la valva. El endocarpio b también está lignificado y estas dos regiones de células lignificadas proporcionan, cuando el fruto madura se seca, tensiones mecánicas que facilitan la apertura de la silicua.

    En los últimos años, la gran diversidad y el potencial de las herramientas genéticas disponibles para Arabidopsis ha hecho posible la identificación de diversos genes implicados en la correcta diferenciación de los tejidos y estructuras que conforman el gineceo, siendo en su mayoría elementos que codifican factores de transcripción (FT). El trabajo de varios grupos de investigación, incluido el nuestro, ha permitido comenzar a esclarecer las GRN que participan en la diferenciación y coordinación de los procesos de desarrollo del carpelo y del fruto. De esta forma, son numerosos los estudios que durante las últimas décadas han centrado el interés de su trabajo tanto en el origen como en la conservación funcional de los módulos de identidad del gineceo. Gracias a la creciente disponibilidad y el desarrollo de nuevas tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS), junto con los enfoques pioneros de la biología de sistemas, se han podido reconstruir filogenias robustas que incluyen un mayor muestreo taxonómico, con el objetivo de proponer nuevas hipótesis evolutivas, así como arrojar más luz sobre las redes de regulación génica (GRNs) que dirigen procesos de desarrollo clave. Sin embargo, la mayor parte del conocimiento sobre las bases moleculares de la morfogénesis del carpelo y del fruto proviene de estudios genéticos en A. thaliana. Si bien el conocimiento acumulativo derivado de estos trabajos está en constante crecimiento, todavía nos encontramos lejos de comprender completamente cómo se integran todos los componentes de las GRNs que dirigen el desarrollo del gineceo, y cómo variaciones en las funciones e interacciones entre estos componentes producen diferentes alteraciones en el desarrollo. Por estas razones, sería necesario complementar estos estudios previos realizando una investigación adicional en especies de diferentes categorías taxonómicas, los cuales todavía son escasos. De ese modo, podemos centrar nuestro interés principal en aquellos elementos que dirigen programas genéticos esenciales, como los procesos morfogenéticos que determinan la estructura del carpelo y el fruto, apertura de la vaina o la formación de estilo y estigma, ya que ambos tejidos solo se encuentran en las angiospermas y están estrechamente relacionados con el origen evolutivo del gineceo.

    En esta tesis, nuestro propósito es contribuir a este objetivo general mediante el uso de enfoques alternativos y potencialmente complementarios a los análisis genéticos habitualmente más utilizados. En este contexto, hemos propuesto tres objetivos específicos:

    Inicialmente, utilizamos la lógica booleana para modelar la GRN que dirige la diferenciación de la zona de dehiscencia en el fruto de Arabidopsis.

    Los frutos se pueden dividir en dos grandes categorías: secos y carnosos. Mientras que los últimos han evolucionado para ser atractivos para los animales que los comen y, por lo tanto, actúan como vectores para la propagación de las semillas, los frutos secos generalmente dependen del viento u otras fuerzas mecánicas para dispersar las semillas. Muchos frutos secos se abren una vez maduros para liberar las semillas directamente al entorno. Para ello, deben someterse al llamado proceso de dehiscencia o rotura de la vaina, que generalmente implica el desarrollo de tejidos especializados, los cuales en última instancia, permiten la apertura controlada del fruto en la etapa óptima de maduración de la semilla. El modo de apertura del fruto es una propiedad ecológica y agronómica de interés para la mejora de los cultivos, por lo que, durante las últimas dos décadas, muchos esfuerzos de investigación se han centrado en comprender en mayor detalle las bases moleculares de este proceso, principalmente en la planta modelo Arabidopsis thaliana. En realidad, los componentes maestros de la GRN que dirigen la morfogénesis de la DZ en el fruto de Arabidopsis son bien conocidos desde hace bastante tiempo. Sin embargo, a pesar de la gran cantidad de datos experimentales generados hasta el momento, todavía no entendemos al completo la compleja dinámica que subyace a esta red transversal. Por ejemplo, no solo debemos aclarar las interacciones moleculares a través de las cuales factores como SHATTERPROOF (SHP) o INDEHISCENT (IND) determinan la diferenciación de las capas celulares adyacentes de lignificación y separación, sino también cómo se excluye la expresión de ALCATRAZ (ALC) de la capa de lignificación, limitándose solo a la capa de separación y considerando que no se ha identificado represor alguno hasta la fecha.

    Por estas razones entre otras, en este estudio proponemos por primera vez, un modelo mínimo para identificar la GRN compuesta por el conjunto de componentes necesarios y suficientes que nos permitan simular computacionalmente y de manera satisfactoria la diferenciación de los diferentes tejidos que conforman el eje medio-lateral de A. thaliana. De este modo, consideramos las redes dinámicas booleanas sincrónicas como una eficiente aproximación mecanicista para proporcionar un marco de trabajo formal y sistémico, mediante la implementación de una herramienta estratégica para la inferencia de redes, la cual se ha utilizado con éxito en diferentes organismos y procesos biológicos. No obstante, a pesar de integrar todos los datos robustamente contrastados y publicados previamente en relación con la formación de la DZ a través de un modelo booleano discreto, estos datos conocidos hasta el momento no fueron suficientes para explicar la aparición de los patrones de expresión que conforman los cuatro destinos celulares esperados. Por lo tanto, estos resultados insatisfactorios nos hicieron plantearnos la necesidad de proponer nuevas interacciones y/o componentes hipotéticos adicionales, así como revisar la literatura reciente para incorporar elementos adicionales a la red. De hecho, cuando incorporamos nuevas interacciones y sometimos nuestra nueva red propuesta a exhaustivas pruebas de validación (líneas de simulación de mutantes de pérdida y ganancia de función, perturbaciones en las funciones booleanas y conversión a un modelo de aproximación continua), fuimos capaces de recuperar en gran medida el comportamiento dinámico esperado de los participantes de la DZ. Este nuevo modelo integrador nos sirvió por tanto para evaluar la robustez de los modelos genéticos actuales, inferidos a partir de información fragmentada, así como identificar posibles inconsistencias o ausencia de elementos necesarios no considerados hasta el momento. Esta estrategia nos permitió proponer un conjunto de reglas hipotéticas junto con la inclusión de un componente adicional, el factor de transcripción NO TRANSMITTING TRACT (NTT), como elemento crucial de esta GRN. Con esta nueva configuración, el modelo propuesto recupera los patrones de desarrollo observados experimentalmente y proporciona nuevas hipótesis a validar en futuros trabajos, lo que en última instancia puede facilitar la manipulación biotecnológica de caracteres en frutos de especies de cultivo de interés comercial.

    En segundo lugar, utilizamos una aproximación transcriptómica para identificar elementos regulados por HECATE3 (HEC3), un factor de transcripción clave para el desarrollo del estigma y el tracto de transmisión, que, curiosamente, está altamente relacionado con INDEHISCENT (IND), un gen esencial para la diferenciación de la zona de dehiscencia.

    De acuerdo con este enfoque, tres factores de transcripción bHLH estrechamente relacionados, HECATE1 (HEC1), HEC2 y HEC3, con funciones parcialmente redundantes, actúan como centro de integración para controlar diversos procesos del desarrollo a lo largo del ciclo de vida de A. thaliana y podrían conservar funciones biológicas similares en otras especies no pertenecientes a la familia de las brasicáceas. Por ejemplo, estos genes HEC desempeñan un papel esencial desde etapas tempranas del desarrollo, actuando como reguladores positivos de la fotomorfogénesis, hasta fases tardías del desarrollo del carpelo y el fruto, lo que propició el ya comentado éxito reproductivo de estas plantas. Así, tanto en el contexto del SAM como en etapas posteriores del desarrollo del gineceo, HEC1 heterodimeriza con SPATULA (SPT) y ambos actúan como moduladores transcripcionales al regular las actividades antagónicas entre las fitohormonas auxinas y citoquinas. De esta forma, los factores HEC coordinan el ritmo entre la proliferación y diferenciación de las células madre, promoviendo las respuestas a citoquinas en la zona central del SAM y restringiendo el sistema de retroalimentación de auxinas en los flancos. En etapas posteriores del desarrollo, los triples mutantes de pérdida de función, hec1 hec2 hec3, muestran una acusada disminución de la fertilidad como consecuencia de graves defectos en el tracto de transmisión, septum y desarrollo del estigma, semejantes a los descritos en los mutantes spt. Por el contrario, la sobreexpresión de los genes HEC induce la aparición de fenotipos con formación de tejido estigmático ectópico, relacionados con la regulación directa de los transportadores de auxinas PIN-FORMED1 (PIN1) y PIN3, la cual es imprescindible para establecer la polaridad apical-basal y garantizar un correcto cierre apical tanto del estilo como del estigma. HEC y SPT no son los únicos reguladores maestros que especifican la identidad de estilo y estigma, también los factores de transcripción STYLISH (STY) y NGATHA (NGA) promueven la expresión de genes de biosíntesis de auxinas, como YUCCA4, con la consiguiente acumulación de estas en el dominio apical del pistilo. De este modo, los cuádruples mutantes nga de pérdida de función, así como diferentes combinaciones de mutantes de la familia SHORT INTERNODES (SHI)/STYLISH (STY)/SHI RELATED SEQUENCE (SRS), no forman tejidos apicales y muestran esterilidad femenina. En concordancia con estos resultados, los factores NGA y SHI/STY/SRS presentan patrones de expresión comparables y dianas comunes, de modo que solo la sobreexpresión simultánea de NGA3 y STY1 es suficiente para dirigir la formación de tejido estilar ectópico en toda la superficie del ovario. Además, una vez que el fruto está maduro, resulta imperativo el establecimiento de un mínimo local de auxinas para la especificación de la capa de separación del margen de valva a lo largo de la DZ de la silicua. Dentro de la familia de las brasicáceas, los genes similares a HEC son los homólogos más cercanos al factor de transcripción IND, cuya función parece estar conservada en esta familia y es indispensable en la formación de la DZ del fruto. Sin embargo, de acuerdo con los estudios filogenéticos que demuestran que los ortólogos de IND están confinados a la familia de las brasicáceas, cualquier esfuerzo por asignar locus de carácter cuantitativo con genes de tipo HEC, relacionados con el proceso de dehiscencia y fuera de esta familia, ha sido infructuoso. También resulta especialmente llamativo el papel de los genes HEC en Arabidopsis, participando en la deposición de lignina, dehiscencia de la antera o, más concretamente, la función de HEC3 en la abscisión de las semillas. Asimismo, los factores HEC e IND interactúan físicamente con SPT y comparten dianas comunes involucradas en procesos de separación celular como las poligalacturonasas ADPG1 y ADPG2. Por lo tanto, considerando las numerosas evidencias experimentales en las que estas GRN comparten componentes similares a la DZ, parece plausible la hipótesis de la neofuncionalización de IND a partir de ancestros similares a HEC para dirigir la especificación de la DZ, un papel que en otras especies puede depender de genes diferentes a los factores de tipo HEC.

    Para comprender mejor el papel de HEC3 en el desarrollo del pistilo, decidimos hacer uso de la secuenciación masiva paralela de ARN (RNA-Seq), una potente tecnología basada en secuenciación masiva de nueva generación (NGS), la cual se ha implementado con éxito en diversas especies de plantas para la obtención de perfiles transcripcionales. De esta manera, nuestros datos experimentales nos permitieron identificar una subfamilia B-6 de factores de respuesta al etileno (ERF), el clado SHINE (SHN) de factores de transcripción, incluidos dentro de la familia ERF/APETALA2 (AP2), como efectores regulados transcripcionalmente por HEC3 de manera positiva. De esta forma, revelamos una función hasta el momento desconocida de los genes SHN en el desarrollo del tracto de transmisión y ampliamos la información disponible para elucidar la función de HEC en las GRN implicadas en el desarrollo del gineceo.

    Finalmente, en el tercer y último capítulo de esta tesis, llevamos a cabo una caracterización del proceso de morfogénesis del gineceo y el fruto, así como un ensamblaje de novo del transcriptoma de Lepidium dydimum, una especie filogenéticamente cercana a Arabidopsis, pero sin embargo, con una morfología de fruto muy diferente.

    De hecho, la arquitectura floral de las brasicáceas está mayormente conservada, aunque existe una gran diversidad en la forma de sus frutos, los cuales presentan diseños estructurales relativamente sencillos, con formas cilíndricas, discoidales o esféricas, hasta estructuras más complejas, por ejemplo, con forma de corazón. Las diferencias entre especies cercanas pueden surgir de la fijación de mutaciones de un número relativamente reducido de importantes genes morfogenéticos y las similitudes en la morfología del fruto no siempre están necesariamente vinculadas a la proximidad filogenética, encontrando especies estrechamente relacionadas con frutos muy dispares y viceversa. Esto sugiere que los procesos morfogenéticos que determinan la estructura del carpelo y el fruto exhiben una alta plasticidad y, hasta cierto punto, todavía son vagamente comprendidos, a pesar haberse identificado numerosos genes que dirigen el patrón estructural del fruto en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Es más, los frutos de Arabidopsis son comparativamente simples en su estructura y, por tanto, un análisis complementario del desarrollo del fruto en parientes cercanos con diferentes morfologías frutales, podría proporcionar un marco de trabajo para profundizar en el estudio de los procesos de determinación de la morfología. En el género Lepidium, uno de los géneros más numeroso de las brasicáceas con aproximadamente 250 especies, la reducción de órganos es un rasgo distintivo de más de la mitad de todas sus especies, a través de tres mecanismos diferentes, en los cuales la reducción localizada en la función B de los genes de identidad de órganos florales, junto con el aumento de la función C, podrían estar directa o indirectamente involucrados. En estas especies, los pétalos están ausentes y el número de estambres se reduce de seis a dos por flor. Además de su gran variación en la morfología del fruto, las estrategias de dispersión de semillas evolucionaron independientemente de frutos dehiscentes a indehiscentes varias veces dentro del género, en comparación con el típico fruto dehiscente de las brasicáceas, lo que lo convierte en un modelo altamente adecuado para el estudio del mecanismo de dehiscencia. Los análisis funcionales demostraron un alto grado de conservación en las rutas genéticas que dirigen el proceso de dehiscencia del fruto entre Lepidium campestre y Arabidopsis thaliana, junto con estudios previos que incluyeron especies de brasicáceas distintas de A. thaliana.Una de las especies representantes con dos estambres en este género es L. didymum L. (sinónimo: Coronopus didymus (L.) Smith), una mala hierba autóctona de América del Sur y ampliamente distribuida en la mayoría de los países lecheros del mundo, que ha causado importantes pérdidas económicas para la industria durante muchos años. Las vacas que ingieren esta maleza producen leche contaminada con propiedades organolépticas desagradables para el consumidor, las cuales no se logran reducir sino que se intensifican mediante las técnicas convencionales de pasteurización al vacío. Además, esta herbácea dispersa miles de valvas de frutos por planta y forma abundantes y persistentes bancos de semillas no latentes en el suelo cultivable y en los pastizales. El conjunto de factores de transcripción, generalmente denominados genes de identidad del margen de valva, son bien conocidos por su función en la correcta especificación de la DZ del fruto. Sin embargo, la transferencia del conocimiento adquirido en los sistemas genéticos de desarrollo en Arabidopsis a otras especies de la familia Brassicaceae, se ve obstaculizada por la falta de recursos genómicos o transcriptómicos disponibles.

    En este trabajo, emprendimos pues un doble enfoque para generar nuevas herramientas para el estudio de la diversidad morfológica y la evolución dentro de las brasicáceas, eligiendo a L. didymum como una especie modelo novedosa para estudios comparativos de evolución y desarrollo (evo-devo), considerando las notables diferencias con respecto a A. thaliana, a pesar de ser especies estrechamente emparentadas. Por un lado, realizamos una caracterización morfológica precisa de la ontogenia floral y el desarrollo del pistilo y el fruto, para revelar las similitudes y diferencias con especies bien estudiadas en la familia, como A. thaliana, Cardamine hirsuta u otras especies de Lepidium. Nuestra descripción detallada de los eventos de desarrollo que acontecen en los diferentes órganos, así como la disponibilidad de un primer transcriptoma ensamblado, proporcionará el conjunto de herramientas necesarias para emprender análisis genéticos moleculares en esta especie y, por extensión, ayudará a ampliar y profundizar en el conocimiento de los procesos evolutivos que han llevado a la amplia diversidad existente en la morfología del fruto en las brasicáceas. Por otro lado, optamos de nuevo por el uso del RNA-Seq como herramienta ampliamente contrastada, al haberse aplicado con éxito para la secuenciación y ensamblaje de transcriptomas completos, tanto en plantas modelo como en otras especies no consideradas modelo. No obstante, hasta la realización de este estudio, no se había publicado ningún transcriptoma completo de Lepidium. Para el ensamblaje del transcriptoma, aprovechamos la disponibilidad de un genoma secuenciado de una especie estrechamente relacionada, L. meyenii, que utilizamos como referencia para ensamblar los transcritos de hojas e inflorescencias de L. didymum. A su vez, nuestro ensamblaje podría ayudar a estructurar el genoma, corregir la anotación o refinar los modelos genéticos propuestos para el genoma de L. meyenii. Además, recientemente, se logró implementar con éxito una estrategia para estudiar las bases moleculares de la variación morfológica de la hoja entre Cardamine hirsuta y A. thaliana. Siguiendo un enfoque similar al de estos autores, nuestro ensamblaje del transcriptoma de L. didymum, combinado con los abundantes recursos genéticos disponibles para Arabidopsis, permitirá la identificación de los genes homólogos entre ambas especies con un papel importante como reguladores del desarrollo en base a la información ya conocida en A. thaliana.

    Este transcriptoma debe ser un recurso útil para caracterizar un sistema modelo alternativo destinado a estudiar las bases moleculares subyacentes a los cambios en la morfología y la dehiscencia del fruto, junto con la aportación de los resultados anatómicos obtenidos.